玻璃體條件培養(yǎng)液對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長活性及細(xì)胞周期的影

玻璃體條件培養(yǎng)液對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長活性及細(xì)胞周期的影 目的：探討在含有人玻璃體的條件培養(yǎng)液作用下體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮（HRPE）細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長活性及細(xì)胞周期的改變。方法：將HRPE細(xì)胞培養(yǎng)在含100，250，500，1 000mL/L人玻璃體的DMEM條件培養(yǎng)液(VCM)。用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，分別用MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的生長活性及細(xì)胞周期的改變。 結(jié)果：不同體積分?jǐn)?shù)的VCM使HRPE細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了改變，HRPE細(xì)胞出現(xiàn)了多核及更早的脫色素，類似成纖維細(xì)胞表型的生長狀態(tài)。含100，250及500mL/L玻璃體體積的VCM處理后HRPE細(xì)胞的增長活性與對(duì)照組相比存在顯著性差異（P均0.01），其中含250mL/L玻璃體的VCM刺激HRPE細(xì)胞增生的能力最強(qiáng)。VCM促使更多的HRPE細(xì)胞進(jìn)入了DNA合成期（S期，613），含250與500mL/L玻璃體體積的VCM使HRPE細(xì)胞出現(xiàn)了異倍體的改變。結(jié)論：一定體積分?jǐn)?shù)的VCM使HRPE細(xì)胞的S期比例增加，細(xì)胞增生能力增強(qiáng)。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞玻璃體MTT細(xì)胞周期DNA倍體流式細(xì)胞術(shù)Effect of vitreous conditional medium on human retinal pigment epithelium cells proliferation and cell dividing cycleAbstractAIM: To investigate the change of cellular morphology, cell proliferative activity and cell dividing cycle in human retinal pigment epithelium (HRPE) cells after treatment of human vitreous conditional medium (VCM). METHODS: HRPE cells were treated with VCM including 100, 250, 500 and 1 000mL/L human vitreous respectively. Cellular morphology, cell proliferative activity and cell dividing cycle changes were observed by invert microscope, MTT assay and Flow Cytometry (FCM) assay respectively.RESULTS: HRPE cells showed polynucleation and pre-depigmenting, fibroblast-like phenotype. For HRPE cells proliferative activity, there was significant disparity between control and experimental group, especially for VCM with 250mL/L vitreous. VCM increased the HRPE cells proportion of phase S (613)and heteroploid was found in VCM with 250 and 500 mL/L vitreous. CONCLUSION: VCM can increase the S phase proption in HRPE cells cell dividing cycle, and increase their proliferative activity. KEYWORDS: retinal pigment epithelium; vitreous; MTT; cell dividing cycle; DNA ploidy； Flow Cytometry0引言增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）是裂孔性視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗的最主要原因,也是眼外傷、血管性和炎癥性視網(wǎng)膜病變的一種結(jié)局1。它的啟動(dòng)和發(fā)展表現(xiàn)為過度的創(chuàng)傷愈合過程，其基本病理過程是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）的移行、增生，在視網(wǎng)膜前和膜后及玻璃體腔內(nèi)形成增生膜，最終增生膜的收縮導(dǎo)致牽拉性視網(wǎng)膜脫離，屬于增生性疾病2?，F(xiàn)已有大量關(guān)于生長因子，細(xì)胞因子通過復(fù)雜的信號(hào)途徑作用于RPE細(xì)胞，導(dǎo)致其病理性增生的實(shí)驗(yàn)性研究的報(bào)道3。目前雖已明確，視網(wǎng)膜神經(jīng)層損傷后造成的RPE細(xì)胞與玻璃體的接觸是PVR發(fā)生的高危因素4,但玻璃體作用的具體機(jī)制仍未明確。有報(bào)道表明在PVR這一病理過程中玻璃體液內(nèi)多種細(xì)胞因子的含量發(fā)生了改變5，6。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PVR患者的玻璃體液能促進(jìn)增生膜中膠原的合成以及增生膜的收縮，從PVR的不同環(huán)節(jié)參與疾病的演進(jìn)過程7，8。Norbert等9發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞接觸正常玻璃體后會(huì)導(dǎo)致其基因表達(dá)的改變。Kirchhof等10則發(fā)現(xiàn)正常玻璃體液能促進(jìn)使HRPE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變、增強(qiáng)其遷移及增生能力。細(xì)胞周期（cell dividing cycle）11指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束開始生長到下一次分裂終止所經(jīng)歷的過程。細(xì)胞周期的概念由Howard和Pelc于1951年首次提出，并將細(xì)胞周期分為間期（G0）與分裂期（M期）。間期包括DNA合成前期（G1 期）DNA合成期（S 期）DNA 合成后期（G2 期）。M期又分為前期、中期、后期和末期。Lajtha 還提出細(xì)胞周期中存在一個(gè)G0期，此期細(xì)胞不參加細(xì)胞增殖，適當(dāng)刺激后可以重新加入細(xì)胞周期開始分裂。為了進(jìn)一步明確玻璃體與HRPE細(xì)胞的接觸在PVR始發(fā)中的具體作用，國內(nèi)外的學(xué)者進(jìn)行了玻璃體對(duì)人RPE（HRPE）細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)性研究。其中涉及到了形態(tài)學(xué)8，生長活性8,12及基因表達(dá)改變9等方面。然而結(jié)論尚不一致，且沒有學(xué)者對(duì)玻璃體作用后HRPE細(xì)胞的細(xì)胞周期改變進(jìn)行觀察，為此我們采用不同體積的人玻璃體作用于培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，觀察HRPE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生長活性及細(xì)胞周期的改變，來探討玻璃體作用后的HRPE在PVR發(fā)生中的作用。1材料和方法1.1材料 取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科角膜移植術(shù)后的正常供體眼（供體年齡2436歲，無眼部及全身疾患）。DMEM購自美國Gibco公司，胰蛋白酶及MTT購自Amresco公司，胎牛血清（FBS）購自天津TBD公司，碘化丙啶（PI）購自SIGMA公司。1.2方法 參照Stramm等13的視杯消化法：取供體眼后，慶大霉素8萬U浸泡消毒20min，去除晶狀體、玻璃體、視網(wǎng)膜神經(jīng)層。用胰酶消化30min，1 000r/min離心收集細(xì)胞，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37, 50mL/L CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。80融合的第35代HRPE細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將玻璃體完全去除視網(wǎng)膜及色素組織后收集于15mL無菌離心管中。0,10 000r/min離心30min，0.22m微孔濾膜過濾，深低溫冰箱-78備用保存。將培養(yǎng)的HRPE細(xì)胞加入VCM后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變并照相。實(shí)驗(yàn)組a: 100mL/L的玻璃體10mL/L FBSDMEM液；實(shí)驗(yàn)組b：250mL/L的玻璃體10mL/L FBSDMEM液；實(shí)驗(yàn)組c：500mL/L的玻璃體10mL/L FBSDMEM液；實(shí)驗(yàn)組d：1 000mL/L玻璃體；對(duì)照組：平衡鹽10mL/L FBSDMEM液。1.2.1 VCM作用后HRPE細(xì)胞活性 將第3代HRPE細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后以2 000個(gè)/孔密度接種于96孔板培養(yǎng)24h后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6h，之后試驗(yàn)組加入不同體積玻璃體的VCM液，每一濃度重復(fù)5孔。繼續(xù)培養(yǎng)1，3，5，7d取出一個(gè)孔板行MTT檢驗(yàn)：每孔加入5g/L MTT20L,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜（DMSO）150L,振蕩器振蕩10min,待紫色結(jié)晶完全溶解后,用酶標(biāo)測(cè)試儀測(cè)定吸光度A 值,測(cè)定波長為570nm。1.2.2 HRPE細(xì)胞周期的檢測(cè) 將第3代HRPE細(xì)胞加入無血清的DMEM培養(yǎng)12h后，棄無血清DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含100，250及500mL/L玻璃體的VCM液繼續(xù)培養(yǎng)48h,對(duì)照組加入平衡鹽溶液繼續(xù)培養(yǎng)48h。胰酶消化后通過400目的篩網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，離心，PBS洗滌1次后750mL/L乙醇固定，加入PI染液1mL,輕柔吹打后混勻，閉光染色20min，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。2結(jié)果2.1 VCM對(duì)培養(yǎng)的HRPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 對(duì)照組的RPE原代細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，可見清晰透明的圓形單核或雙核，細(xì)胞內(nèi)含有較多的色素顆粒，傳代至34代后細(xì)胞內(nèi)無明顯的色素顆粒，細(xì)胞呈梭形或多角形生長。加入100，250及500mL/L的VCM后，RPE細(xì)胞生長旺盛，分裂象明顯，有的細(xì)胞呈多核，類似病理性核分裂，并且細(xì)胞在第2代就已經(jīng)脫色素生長，呈分裂過度的老化狀態(tài)，更快具有纖維細(xì)胞的表型（圖1A,B,2A,B）。2.2 VCM對(duì)HRPE細(xì)胞增生活性的影響 加入100,250及500mL/L VCM后，實(shí)驗(yàn)組的HRPE細(xì)胞較對(duì)照組相比生長明顯旺盛，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均分別有顯著性差異 （P0.01),這種差異在加入VCM培養(yǎng)3d后出現(xiàn)，并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束。其中100mL/L與500mL/L VCM組之間相比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P00.5），但250mL/L VCM組與100mL/L及500mL/L VCM組分別比較差異均有顯著差異（P0.01），說明其中含250mL/L玻璃體的VCM刺激HRPE細(xì)胞發(fā)生增生的作用最強(qiáng)。與此相反，1 000mL/L VCM組的HRPE細(xì)胞逐漸死亡，細(xì)胞數(shù)遞減，在3，5及7d與對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。2.3 VCM對(duì)HRPE細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比HRPE細(xì)胞進(jìn)入S期的比例明顯增多，100mL/L VCM組與對(duì)照組相比處于S期的細(xì)胞比例增加了8.3（P0.01)，同時(shí)伴隨著G1期比例的下降及G2期比例的升高。尤其值得注意的是在250mL/L及500mL/L的VCM組，有微量異倍體的出現(xiàn)，與對(duì)照組及100mL/L VCM組1 000mL/L為二倍體的細(xì)胞生長狀態(tài)明顯不同。其中250mL/L VCM組的三倍體較500mL/L VCM組增長了2.4（P0.05），說明250mL/L VCM組使HRPE細(xì)胞發(fā)生異倍體的能力最強(qiáng)（表2）。圖 1 原代HRPE細(xì)胞（倒置顯微鏡100） A：加250mL/L的VCM后，見有異倍體的RPE細(xì)胞生長,:三核及多核細(xì)胞；B 未加VCM的HRPE細(xì)胞生長良好，核分裂相多見，:雙核分裂細(xì)胞圖 2 第2代HRPE細(xì)胞（倒置顯微鏡200） A：加250mL/L VCM的HRPE細(xì)胞呈明顯老化狀態(tài)，細(xì)胞扁平，無色素，類似纖維細(xì)胞；B：未加VCM的HRPE細(xì)胞仍含有較多的色素顆粒，細(xì)胞呈六角形或梭形生長