乙型肝炎病毒對腎小管上皮細(xì)胞直接作用的實(shí)驗(yàn)研究

乙型肝炎病毒對腎小管上皮細(xì)胞直接作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討乙型肝炎病毒（HBV）在體外對人腎小管上皮細(xì)胞（HKC）的直接致病作用。方法: HBV體外感染HKC：培養(yǎng)的HKC傳至6孔板中，接種密度為1106個/ml，孵育24 h 后分受感染和陰性對照兩組。受感染組加入0.5 ml HepG2.2.15細(xì)胞上清液（含有HBV）；陰性對照組加入0.5 ml 10% FCS-DMEM/F-12培養(yǎng)液。兩組HKC繼續(xù)孵育72 h，消化，離心沉淀，PBS清洗，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (FQ-PCR)檢測兩組HKC中的HBV DNA 含量。HBV對體外培養(yǎng)的HKC細(xì)胞直接作用：HKC細(xì)胞傳至24孔板中，接種密度為1105個/ml，受感染組分三個亞組，分別加入100l、200l和300l的感染用HepG2.2.15細(xì)胞上清液；陰性對照組為接種HKC后加入培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；陽性對照組為HepG2.2.15細(xì)胞上清液。各組的每孔終體積均為2 ml，每組設(shè)3復(fù)孔。孵育72 h后收集各孔上清液，ELISA法檢測轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF-1）的表達(dá)。結(jié)果:受感染組HKC的基因組中檢測到HBV DNA。受感染組的三個亞組細(xì)胞培養(yǎng)上清的TGF-1與陰性對照組比較差異均有顯著性。結(jié)論:HBV可感染HKC并促進(jìn)其分泌TGF-1。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；肝炎病毒，乙型；感染；HepG2.2.15細(xì)胞Abstract:Objective: To investigate the direct pathogenic effects of Hepatitis B virus（HBV）on human tubular kidney cells (HKCs) in vitro. Methods: HKCs were infected by HBV: HKCs were seeded into six well cluster dishes, at 1106 cells per ml. 24 hours later， HKCs were divided into control group and infected group. Cells of infected group were cultured with 0.5 ml supernatant of HepG2.2.15 cells, while 0.5 ml 10% FCS-DMEM/F-12 was used in control group. 72 h later, all of the HKCs were removed and then washed with PBS. HBV DNA was detected by fluorescent quantitation polymerase chain reaction (FQ-PCR). Direct pathogenic effects of HBV on HKCs: HKCs were seeded into twenty four well cluster dishes, at 1105 cells per ml. Negative control group, positive control group and infected group were established. HKCs of infected subgroups were cultured with 100l, 200l and 300l supernatant of HepG2.2.15 cells, respectively. Cells of negative control group were cultured with FCS-DMEM/F-12. Cells of positive control group were cultured with supernatant of HepG2.2.15. Supernatant from each well was collected after 72 hours. The expression of TGF-1 was detected with ELISA. Results: HBV DNA was observed in the genome of HKC. In the HKC, persistent infection of HBV enhanced the expression of transforming growth factor 1（TGF-1）. Conclusion: Human tubular epithelial cell is susceptible to HBV and HBV infection can enhance the expression of TGF-1.Key words:cell culture techniques; Hepatitis B virus; infection; HepG2.2.15 cell乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)性腎炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。雖然免疫復(fù)合物介導(dǎo)機(jī)制已被多數(shù)學(xué)者接受，但對于患者腎組織存在的HBV DNA和病毒抗原與腎炎發(fā)生的關(guān)系仍有爭論，至今并不明確腎臟固有細(xì)胞對HBV的易感性。已知在免疫反應(yīng)過程中，包括腎小管上皮細(xì)胞（HKC）在內(nèi)的腎臟固有細(xì)胞可通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF-1）等細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和影響腎臟病進(jìn)展。已有研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者血清TGF-1升高1。本實(shí)驗(yàn)以HepG2.2.15細(xì)胞作為提取病毒的來源，以體外培養(yǎng)的正常HKC為研究對象，進(jìn)行了HKC對HBV易感性的探討，同時觀察了HKC在HBV作用下其TGF-1的分泌情況。1材料和方法1.1試劑及儀器細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國CORNING公司產(chǎn)品），DMEM/F-12、DMEM高糖型(美國Hyclone Lab 公司產(chǎn)品)，胎牛血清(購自杭州四季清)，G418(GIBCO公司產(chǎn)品)，TGF-1的ELISA檢測試劑盒（上海晶美生物工程有限公司產(chǎn)品），HbsAg和HbeAg的ELISA檢測試劑盒（上?？迫A生物工程有限公司產(chǎn)品），HBV核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司產(chǎn)品）。1.2方法1.2.1HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)：自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心購取已貼壁生長的HepG2.2.15細(xì)胞，采用含10%胎牛血清、0.238% Hepes(pH7.0)、0.3%谷氨酰胺、380g/ml G418、100 IU/ml青霉素和鏈霉素及以5% NaHCO3調(diào)pH至7.07.2的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2孵育箱37 培養(yǎng)，細(xì)胞呈鋪路石樣貼壁生長，35 d換液一次。當(dāng)長至約 80%融合時，予以傳代。1.2.2HKC的培養(yǎng)：自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心購取已貼壁生長的HKC，用10% FCS-DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，以5% NaHCO3調(diào)pH 至7.07.2。在培養(yǎng)基加入100 IU/ml青霉素、鏈霉素、0.238% Hepes(pH7.0)和0.3%谷氨酰胺，在5% CO2 孵育箱37 培養(yǎng)。細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長，3 d換液一次。當(dāng)長至約80%融合時，予以傳代。1.2.3感染用HepG2.2.15細(xì)胞上清液的制備：將HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)至約80%融合時，吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液并加入胰酶，吸取的培養(yǎng)液離心后留取上清，-70 保存?zhèn)溆?，稱之為“陽性對照用HepG2.2.15細(xì)胞上清液”。從中收集經(jīng)胰酶消化的HepG2.2.15細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，-70 保存?zhèn)溆?；然后將備用的凍存單?xì)胞懸液反復(fù)凍融兩個循環(huán)，離心后取上清，用于感染腎小管上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，稱之為“感染用HepG2.2.15細(xì)胞上清液”。1.2.4HBV感染腎小管上皮細(xì)胞：將HKC傳代至6 孔板，接種密度為1106個/ml，24 h后進(jìn)行HBV 感染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組: 受感染組：往孔板中加入制備好的感染用HepG2.2.15細(xì)胞上清液0.5 ml。陰性對照組：加入0.5 ml 10% FCS-DMEM/F-12培養(yǎng)液。每組終體積均為2.0 ml。兩組HKC繼續(xù)孵育72 h后，0.25%胰蛋白酶+0.05% EDTA消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心，取沉淀，以PBS溶解后離心，反復(fù)洗3次后以200l PBS溶解沉淀，同時吸取受感染組第3次洗液以備DNA提取后HBV DNA的檢測。1.2.5ELISA法檢測TGF-1：將HKC培養(yǎng)至第3天，換液1次，待細(xì)胞生長至80%融合時傳代并接種于96孔培養(yǎng)板，接種密度為1105個/ml。實(shí)驗(yàn)分組：受感染組各亞組：接種HKC后按加入感染用HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液的體積分為3個亞組（體積數(shù)依次為100l、200l和300l）。 陰性對照組：接種HKC后只加入培養(yǎng)液。陽性對照組：陽性對照為感染用HepG2.2.15細(xì)胞上清液，不接種HKC。每組設(shè)4復(fù)孔。受感染組及對照組的終體積均為2 ml。培養(yǎng)至第3天收集上清液, ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-1，檢測步驟按照說明書進(jìn)行，酶聯(lián)檢測使用DIALAB GMBH酶標(biāo)儀，采用單波長(450 nm) 檢測。1.2.6細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞中的DNA提?。翰捎玫鞍酌窴消化，酚、氯仿-異戊醇法提取細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞中的DNA(具體步驟參照文獻(xiàn)2進(jìn)行)。1.2.7FQ-PCR檢測HBV DNA：培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞外液的HBV DNA的FQ-PCR測定按試劑盒使用說明書進(jìn)行， PCR檢測時設(shè)立受感染組、陽性對照(HbsAg陽性的乙型肝炎患者血清)、陰性對照(模板用HKC)、空白對照（ddH2O）及受感染組的第3次洗滌液；以上PCR產(chǎn)物均經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法多個樣本間計量資料的比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。