ILK在cGVHD狼瘡樣小鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用

ILK在cGVHD狼瘡樣小鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用 目的 觀察整合素連接激酶（ILK）在慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼瘡樣小鼠腎臟中的表達，探討其在狼瘡腎炎腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。方法 建立cGVHD狼瘡樣小鼠模型，將小鼠分成正常對照組(A組)、12周模型組(B組) 和16周模型組(C組)，每組6只。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法、western blot、免疫組織化學(xué)法分別檢測ILK 、E-鈣粘蛋白和-平滑肌肌動蛋白（-SMA）mRNA和蛋白在腎組織中的表達。結(jié)果 RT-PCR和western blot方法分別檢測到B、C兩組小鼠腎組織ILK、-SMA mRNA和蛋白表達較A組升高(P均0.01)， E-鈣粘蛋白表達降低(P均0.01)。ILK蛋白和mRNA表達與-SMA表達呈正相關(guān)（r分別為0.83，0.86，P均0.01），與E-鈣粘蛋白表達呈負相關(guān)（r分別為-0.84，-0.89，P均0.01）。免疫組化結(jié)果表明，與A組相比，B、C兩組小鼠腎小管及間質(zhì)均可見ILK、-SMA蛋白顯著表達，而E-鈣粘蛋白的表達顯著減少。結(jié)論 cGVHD狼瘡樣小鼠腎組織中ILK蛋白及mRNA表達明顯上調(diào)，可能通過介導(dǎo)腎小管上皮間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化而參與了狼瘡腎炎腎間質(zhì)纖維化的進程。移植物抗宿主??；狼瘡腎炎；粘蛋白類；腎小管；小鼠；動物實驗Abstract:ObjectiveTo determine the expression of integrin-linked kinase (ILK) in renal tissue of mice with chronic graft versus host disease (cGVHD) lupus nephritis and its relationship with the epithelial-mesenchymal transition.MethodscGVHD lupus nephritis mice models were conducted. All the mice were divided into three groups: group A (control group, n=6), group B (12-week model group, n=6) and group C (16-week model group, n=6).The mice were killed twelve weeks later (group B) or sixteen weeks later (group C), respectively. The protein and mRNA expressions of ILK, alpha-SMA and E-Cadherin in kidney were detected by using immunohistochemistry, western blot and RT-PCR, respectively.ResultsTheprotein and mRNA expression of E-cadherin were significantly down-regulated (P狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）最常見臨床表現(xiàn)之一，其病理改變具有多樣性及不均一性，以腎小球、腎血管、腎間質(zhì)的損害為主要特征，后期可發(fā)展為腎小球硬化、纖維性新月體、間質(zhì)纖維化及其腎小管萎縮等。與其他慢性腎臟疾病一樣，腎臟纖維化是各型LN進展到終末期的必經(jīng)階段。腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，近年來一些研究提示整合素連接激酶（integrinlinked kinase，ILK）可能是介導(dǎo)EMT的關(guān)鍵因子1，但是在LN中EMT的形成以及ILK與EMT關(guān)系的研究報道尚少。我們以慢性移植物抗宿主?。╟hronic graft versushost disease，cGVHD）狼瘡樣小鼠為模型，觀察不同時期ILK、E-鈣粘蛋白和-平滑肌肌動蛋白(-SMA)在腎組織中的表達，并探討ILK在狼瘡腎炎腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用。1材料與方法1.1實驗動物810周齡（C57BL/6JDBA/2）F1代雜交雌性小鼠（以下稱F1代鼠）及46周齡DBA/2雌性小鼠購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心，體重（19.991.99）g，SPF級。1.2模型的建立與分組按隨機設(shè)計原則將F1代鼠分為正常對照組（A組）、12周模型組（B組）及16周模型組（C組），每組6只小鼠。建立cGVHD狼瘡樣小鼠模型。取DBA/2小鼠脾臟、胸腺、淋巴結(jié)細胞，制成單細胞懸液（約60%脾細胞、30%胸腺細胞及10%淋巴結(jié)細胞）。分別于第0、3、7、10天注射于模型組F1代鼠，每次注射給予細胞數(shù)約為50106個。正常對照組于相同時間點經(jīng)尾靜脈注射與單細胞懸液等體積的生理鹽水。于首次注射單細胞懸液之日起，于第12周末處死B組小鼠，于第16周末處死A組和C組小鼠。處死后立即取下腎臟，將腎包膜完全剝離后，一部分保存于-80以備提取總RNA和蛋白質(zhì)，另一部分固定于10%中性福爾馬林溶液中，經(jīng)石蠟包埋后切片進行組織病理檢查及免疫組織化學(xué)實驗。1.3組織病理切片2m連續(xù)切片，至經(jīng)多聚賴氨酸包被的載玻片上，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，分別行蘇木素伊紅（hematoxylineosin，HE）染色和Masson染色。1.4免疫組織化學(xué)SP法進行免疫組化染色。將腎組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫室溫孵育10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，10%正常羊血清封閉，37孵育15min，分別滴加兔抗小鼠ILK抗體（150，Upstate公司）、兔抗小鼠E-鈣粘蛋白抗體（1100，Sigma公司）、兔抗小鼠-SMA抗體（1100，Santecruz 公司）4孵育過夜，再依次加入生物素偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體和辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，各37孵育15min 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，顯微鏡下控制顯色，HE復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片鏡檢。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。1.5western blot取80保存的腎組織5080mg，加適量裂解液后勻漿，冰中靜置30min，離心，取上清，測蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液，煮沸4min，瞬時高速離心，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜情況，TBST洗膜，5BSA封閉，分別加入兔抗小鼠ILK抗體，兔抗小鼠E-鈣粘蛋白抗體、兔抗小鼠-SMA抗體、兔抗小鼠，室溫孵育1.5h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光顯示結(jié)果。圖片掃描保存后用Totallab 2.01分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化。以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達含量。1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)1.6.1總RNA的提取將腎組織從-80冰箱中取出，迅速用Trizol（Invitrogen公司）勻漿后提取總RNA。取5l總RNA進行甲醛變性凝膠電泳，紫外燈下觀察5、18、28s條帶清晰提示完整無降解。1.6.2逆轉(zhuǎn)錄體系在PCR管中加入10逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1l，MgCl2(25mmol/L)2l，Oligo dNTPs(10 mmol/L)2l，RNA酶抑制劑0.25l，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA公司）1l，總RNA275l，30，10min后，42逆轉(zhuǎn)錄50min，99滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5min，5，5min，所得的cDNA保存于-20，用于PCR擴增。1.6.3PCR擴增ILK、-SMA、E-鈣粘蛋白及GAPDH內(nèi)參照引物由DNA club軟件設(shè)計，由Invitrogen公司合成，序列見表。表引物序列（略）PCR反應(yīng)體系5PCR緩沖液10l，MgCl2(25mmol/L) 4l，dNTPs(10 mmol/L)1l，上下游引物各1l（10mol/L），cDNA模版1l，TaqDNA聚合酶（5U/l ）(TAKARA公司)0.25l，補足雙蒸水至50l。97預(yù)變性后，94變性30s，59退火50s，72延伸1min為一個循環(huán)，共38個循環(huán)后，72終末延伸7min。1.6.4產(chǎn)物檢測取PCR擴增產(chǎn)物5l，于含有5g/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，45min。于Image Master VDS凝膠掃描儀上成像，用Totallab 2.01凝膠圖像分析軟件進行半定量分析。所有ILK、E-鈣粘蛋白和-SMA擴增產(chǎn)物的吸光度均以GAPDH為基準較正，分別用ILK/GAPDH、E-鈣粘蛋白/GAPDH和-SMA/GAPDH表示。1.7統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用s表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，兩組間比較采用檢驗，兩變量間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。2結(jié)果2.1腎臟病理改變模型組腎小球系膜區(qū)增寬，基質(zhì)大量增生；小管多灶性萎縮，管腔內(nèi)可見蛋白管型及細胞管型，B組間質(zhì)大量單個核細胞浸潤并有基質(zhì)沉積，C組細胞數(shù)減少并出現(xiàn)部分腎小管空泡化。Masson染色可見C組小鼠腎小球囊壁，腎小管間質(zhì)有明顯的膠原纖維沉積，B組膠原纖維較C型組少，主要位于腎小管間質(zhì)。A組腎組織未見明顯膠原沉積。2.2免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果見圖。ILK在A組腎小球及腎小管上皮細胞中無明顯表達，在B組小鼠腎組織小管及間質(zhì)中表達增強，而在C組小鼠腎組織中表達較B組進一步增加。E-鈣粘蛋白幾乎表達于A組所有上皮細胞中，而在B組、C組小鼠隨著腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)的破壞，表達減弱。A組-SMA僅表達于血管平滑肌細胞和間質(zhì)少量成纖維細胞，B組小鼠腎小管上皮細胞和間質(zhì)-SMA的表達開始升高，C組小鼠腎小管上皮細胞和間質(zhì)中-SMA陽性細胞數(shù)明顯增加。A圖A組腎小球及腎小管上皮細胞中無明顯表達；（略）B圖B組小鼠腎組織小管及間質(zhì)中表達增強；（略）C圖C組小鼠腎組織中表達較B組進一步增加（略）圖ILK免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果（SP法400倍放大）（略）2.3western blot蛋白定量測定結(jié)果見表。與A組比，B、C兩組ILK、-SMA蛋白含量顯著增加E-鈣粘蛋白蛋白含量顯著減少（P均0.01)；C組與B組相比E-鈣粘蛋白的蛋白含量下降，ILK、-SMA蛋白含量增加(P均0.01)。ILK與E-鈣粘蛋白的蛋白表達呈負相關(guān)（r-0.84，P0.01)，與-SMA蛋白的表達呈正相關(guān)（r0.83，P0.01)。