人腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡及調(diào)控

人腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡及調(diào)控人腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡及調(diào)控 2016/03/10 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2016年第四期摘要目的研究高糖誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制。方法以人腎近曲小管上皮細(xì)胞株為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組、高糖組、甘露醇組。、流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞的增殖和凋亡狀況；法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性；法分析淋巴細(xì)胞瘤（）及家族蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，高糖組能抑制細(xì)胞的體外增殖，下調(diào)抑制凋亡作用的蛋白表達(dá)，上調(diào)促凋亡作用的蛋白、表達(dá)（）；流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞周期有明顯的變化，且隨葡萄糖濃度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明顯上升（），并且酶原降解及活性表達(dá)也呈上升趨勢(shì)（）。結(jié)論高糖能抑制細(xì)胞體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)及家族調(diào)控細(xì)胞的凋亡。關(guān)鍵詞高糖；凋亡；表達(dá)細(xì)胞凋亡是生理性過(guò)程，不同于細(xì)胞壞死；凋亡細(xì)胞能產(chǎn)生吞噬和清除碎片的凋亡小體，避免周圍環(huán)境中細(xì)胞損害，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。糖尿病腎?。ǎ┌l(fā)病機(jī)制復(fù)雜，早期，腎臟通過(guò)細(xì)胞凋亡等應(yīng)急反應(yīng)來(lái)清除過(guò)度增殖的內(nèi)皮細(xì)胞，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；晚期，隨著腎功能障礙，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞，細(xì)胞凋亡過(guò)度，致使腎損害也加劇。了解和干預(yù)腎小管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有助于延緩進(jìn)展。該研究采用體外培養(yǎng)人腎近曲小管上皮細(xì)胞株細(xì)胞，分析高糖壞境下細(xì)胞的增殖和凋亡狀況、淋巴細(xì)胞瘤（，）及家族蛋白表達(dá)的變化，并進(jìn)一步探討這些作用可能的分子調(diào)控機(jī)制。材料與方法材料低糖（）（美國(guó)公司）；、醫(yī)用甘露醇（北京國(guó)藥集團(tuán)公司）；原裝小牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院贈(zèng)送，液氮保存；（安徽碧云天生物試劑公司）；一抗、（美國(guó)公司）；（美國(guó)公司）；二抗（美國(guó)公司）。方法細(xì)胞培養(yǎng)和分組液氮取出細(xì)胞，水浴解凍，迅速接種于含小牛血清低糖（葡萄糖濃度），、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。胰酶消化傳代，備用。分組：對(duì)照組（葡萄糖濃度為）、高糖組（葡萄糖濃度分別為、）和甘露醇組（葡萄糖濃度甘露醇濃度分別為、）。法檢測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，胰酶消化，按分組，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照前期報(bào)道操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)次。分析細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，胰酶消化傳代，制成細(xì)胞懸液，取合適的量平均接種于孔板，次日按分組，刺激，各組胰酶消化制成約個(gè)細(xì)胞懸液。結(jié)合液重懸，加入染色液，避光孵育。冷凍離心（），去除上清液，再用結(jié)合液重懸，孔染色液，震動(dòng)器輕輕混勻；錫箔紙包裹置冰上孵育，然后上機(jī)檢測(cè)。蛋白酶原活性檢測(cè)原理：依據(jù)抗原抗體結(jié)合的原理，細(xì)胞內(nèi)活性的、能在體外與相應(yīng)的酶結(jié)合，催化底物顯色反應(yīng)，通過(guò)吸光度（，）值來(lái)間接反應(yīng)、的活性。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，按步驟操作，分組后置于培養(yǎng)箱連續(xù)刺激，胰酶消化，冷凍離心（），按照法操作，依次加入酶、底物、酶標(biāo)儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)次。法檢測(cè)提取總蛋白：按分組批量培養(yǎng)，刺激后，棄去原液并用洗去殘留液體，置冰上，每瓶加裂解液充分裂解，細(xì)胞刮子收集細(xì)胞，低溫冷凍離心（），上清液置于備用，測(cè)定蛋白濃度，每組加入濃縮蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸，分裝備用，置于保存。配制，微量加樣針上樣，先用電泳濃縮膠，電泳分離膠，冰浴轉(zhuǎn)膜，伊利脫脂牛奶封閉，洗膜，置于一抗為（），（），（），（），（），（），（），過(guò)夜。相應(yīng)二抗分別為山羊抗小鼠（），山羊抗鼠（），山羊抗兔（），山羊抗鼠（），山羊抗鼠（），山羊抗兔（），山羊抗小鼠（），孵育，洗膜次，暗室內(nèi)膠片顯影、定影，重復(fù)實(shí)驗(yàn)次。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。條帶的灰度值用分析軟件測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素方差分析，數(shù)據(jù)用珋表示。組間計(jì)量資料用方差分析。結(jié)果高糖對(duì)細(xì)胞的體外增殖的影響結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)檢測(cè)，顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（，）。組間兩兩比較顯示，與對(duì)照組比較，高糖組（、）的值依次降低，且糖濃度為抑制率達(dá)（，）；而甘露醇組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明體外高糖能抑制細(xì)胞的體外增殖，與高晶體滲透壓無(wú)關(guān)。見(jiàn)表。高糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（，）。組間兩兩比較顯示：與對(duì)照組（）比較，高糖組（圖、）中期凋亡與末期凋亡所占的比例明顯升高，并且末期凋亡所占的比例隨著葡萄糖濃度的升高而升高；從圖、中可以觀察到甘露醇對(duì)細(xì)胞的凋亡影響不明顯。提示高糖能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與高晶體滲透壓無(wú)關(guān)。見(jiàn)圖、表。高糖對(duì)蛋白酶原活性的影響單因素方差分析顯示高糖能夠增強(qiáng)、活性（、，）。組間兩兩比較顯示：與對(duì)照組比較，高糖組、活性呈上升趨勢(shì)，但甘露醇組活性沒(méi)有明顯變化。見(jiàn)圖。高糖對(duì)及蛋白酶原家族蛋白表達(dá)的影響單因素方差分析顯示高糖上調(diào)、蛋白表達(dá)（、，）；下調(diào)蛋白表達(dá)（）。組間兩兩比較顯示：與對(duì)照組比較，家族蛋白表達(dá)量有所下降，、蛋白表達(dá)量顯著上升，且的比值也呈上升趨勢(shì)。另外剪切后的蛋白酶原家族、蛋白表達(dá)明顯增加，見(jiàn)圖。討論是糖尿病重要并發(fā)癥之一，其基本病理特征主要表現(xiàn)為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)聚集與降解紊亂，導(dǎo)致腎小球病態(tài)增生、基底膜增厚和動(dòng)脈硬化等，這些改變嚴(yán)重影響腎小管的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，誘發(fā)上皮細(xì)胞程序性凋亡，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。國(guó)外相關(guān)報(bào)道證實(shí)終末期腎病腎小球損傷多數(shù)從腎小球上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）損傷開(kāi)始；在糖尿病的早期，長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下的細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致腎小球超過(guò)濾、誘發(fā)氧化應(yīng)激、糖化終產(chǎn)物堆積、蛋白激酶的激活、多元醇化、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的過(guò)表達(dá)和炎癥等，這些因素致使腎小管基底膜增厚，養(yǎng)分供應(yīng)受阻，引起腎小管上皮細(xì)胞萎縮，導(dǎo)致腎衰竭。因此干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，維持上皮細(xì)胞活性，能有效的減緩腎臟的衰竭。體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖容易導(dǎo)致上皮、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙，從而誘發(fā)多種疾病，如型糖尿病等；因此，控制血糖，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡修復(fù)損傷的細(xì)胞有重要的臨床意義。本研究模擬體內(nèi)高糖環(huán)境，選取穩(wěn)定性較好的人腎近曲小管上皮細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)。作為維持近曲小管功能的上皮細(xì)胞，細(xì)胞的功能障礙在的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。實(shí)驗(yàn)表明高糖刺激后細(xì)胞的增殖抑制，且出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。家族和共同參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。家族通過(guò)調(diào)控與、之間的比例，改變線粒體膜的通透性釋放細(xì)胞色素等促凋亡蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而家族分工協(xié)作，感受線粒體發(fā)出的死亡信號(hào)；屬于凋亡效應(yīng)子，能直接引起細(xì)胞凋亡；能促使表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，參與細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)家族和家族均被激活，表現(xiàn)為蛋白表達(dá)量下降，、蛋白表達(dá)量上升，且的比值也呈上升趨勢(shì)。另外蛋白酶原家族、酶原降解及活性表達(dá)也呈上升趨勢(shì)。推測(cè)高糖可能是通過(guò)某種途徑激活家族，釋放細(xì)胞色素，引起酶原降解，活化家族啟動(dòng)級(jí)連反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。