微生物發(fā)酵與發(fā)酵工程.ppt

. 微生物發(fā)酵與發(fā)酵工程 一、 微生物發(fā)酵 二、發(fā)酵工程概述 三、應(yīng)用舉例 丙酮丁醇發(fā)酵 一、 微生物發(fā)酵 發(fā)酵 (fermentation) 沒有空氣的生活（ life without air） - 巴斯 德 細(xì)胞在厭氧條件下代謝營養(yǎng)物獲得能量的生 化反應(yīng) 微生物生長并進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過程 發(fā)酵的目的 獲得生物量 獲得目的產(chǎn)物 發(fā)酵的基本流程 保藏菌種 斜面（試管、茄子瓶） 搖瓶（ 12級） 種子發(fā)酵（ 1級或多級） 主發(fā)酵 后處理 無菌操作 接種間 輻射滅菌 化學(xué)滅菌 空氣過濾 發(fā)酵罐 高壓蒸汽滅菌 通氣系統(tǒng) 過濾滅菌 TC 發(fā)酵溫度 t hr 連續(xù)滅菌 間歇滅菌 發(fā)酵過程的 噬菌體 問題 現(xiàn)象 ：發(fā)酵不正常，產(chǎn)量、糖耗、 pH、粘 度、泡沫等 鏡檢 ：溶菌現(xiàn)象 防治 ： 定期檢查 設(shè)備、管道管件、過濾器等 環(huán)境 藥物 ：鰲合劑、抗生素 菌株 ：抗性菌株、菌株輪換 發(fā)酵過程的主要控制參數(shù) 溫度 pH 營養(yǎng) 溶氧 通氣量 攪拌速度 壓力 發(fā)酵類型 I: 產(chǎn)物是初級能量代謝的結(jié)果，一般是糖的直接氧化產(chǎn) 物。 A P or A B C P 例：乙醇發(fā)酵、乳酸發(fā)酵 II: 產(chǎn)物通過能量代謝的間接途徑得到。 A B C D E P 例：檸檬酸發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵 III:產(chǎn)物不是初級代謝形成的，與微生物細(xì)胞的物質(zhì)代謝 無關(guān)。 例：抗生素發(fā)酵 發(fā)酵方式 批式 (batch)發(fā)酵 補(bǔ)料流加 (fed batch)發(fā)酵 連續(xù) (continous)發(fā)酵 批式發(fā)酵的產(chǎn)物形成 生長結(jié)合型 (growth associated)：產(chǎn)物形成與生長的限制 因子相同 非生長結(jié)合型 (growth unassociated) ： 產(chǎn)物形成速度取決于微生物濃度 產(chǎn)物形成速度由與比生長速度無關(guān)的其它因素決定，不能用動力學(xué)方程 描述，但可對具體的發(fā)酵過程簡化一些條件后建立數(shù)學(xué)方程 產(chǎn)乳酸發(fā)酵： 發(fā)酵的后處理 后處理在發(fā)酵工業(yè)中的地位： 普通發(fā)酵產(chǎn)品，后處理成本 60% 基因工程發(fā)酵產(chǎn)品，后處理成本 80% 后處理的一般流程： 發(fā)酵液 分離細(xì)胞 濃縮 粗分離 精分離 制成品 后處理工藝的設(shè)計原則： 產(chǎn)品的性質(zhì) 產(chǎn)品的要求 經(jīng)濟(jì) 環(huán)保 穩(wěn)定 細(xì)胞的分離與破碎 細(xì)胞的分離 過濾（壓濾、抽濾、膜分離） 沉降（重力、離心） 絮凝 細(xì)胞的破碎 物理（超聲、機(jī)械） 化學(xué) 生物 膜分離 微濾（ 0.1 - 10 ） 超濾（ MW1000 - 100000） 固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵 ：微生物在沒有或很少游離水的 潮濕固體培養(yǎng)基上生長與代謝的過程 特點(diǎn) ：投資少、能耗低、原料廉價 傳熱傳質(zhì)差、效率低 應(yīng)用 ：生物農(nóng)藥、飼料、粗酶、食品等 發(fā)酵條件的優(yōu)化 確定優(yōu)化目標(biāo) T S P + B + s 產(chǎn)率 : P ( g/L ) 轉(zhuǎn)化率 : P/(S s ) ( %, g/g ) 生產(chǎn)強(qiáng)度 : P/T ( g/L.h ) 其他 確定影響因素 種子：種齡、接種量 培養(yǎng)基：組分、 pH、滅菌條件 環(huán)境：溫度、 pH、通氣、攪拌、壓力、設(shè)備 二、發(fā)酵工程概述 （一）發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)展及其意義 發(fā)酵？ 生理學(xué)角度： 微生物的無氧呼吸和有氧呼吸 以外的一種生物氧化作用 有機(jī)化合物既是 電子（或氫）供體又是電子（或氫）受體。 工業(yè)生產(chǎn)角度： 利微生物的機(jī)能進(jìn)行物料加 工以獲得工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)或為社會服務(wù)（環(huán)境 保護(hù)）的過程，又稱微生物工程。 發(fā)酵工程的歷史過程 發(fā)酵現(xiàn)象 釀造食品工業(yè) 非食品工業(yè) 青霉 素 抗菌素發(fā)酵工業(yè) 氨基酸 ,核酸發(fā)酵（代謝 控制發(fā)酵） 基因工程菌 動物細(xì)胞大規(guī)模培 養(yǎng) 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 藻類細(xì)胞大規(guī)模培 養(yǎng) 轉(zhuǎn)基因動物 發(fā)酵工業(yè)的第一個轉(zhuǎn)折點(diǎn)： 非食品工業(yè) 發(fā)酵工業(yè)的第二個轉(zhuǎn)折點(diǎn)：青霉素 抗菌 素發(fā)酵工業(yè) 發(fā)酵工業(yè)的第三個轉(zhuǎn)折點(diǎn)：切斷支路代謝 轉(zhuǎn)折點(diǎn) :酶的活力調(diào)控 ,酶的合成調(diào)控 (反饋控 制和反饋?zhàn)瓒?),解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié) , 特殊調(diào)節(jié)控制的利用突變株的應(yīng)用 ,前體、 終產(chǎn)物、副產(chǎn)物等 發(fā)酵工業(yè)的 近代轉(zhuǎn)折點(diǎn) ：基因、動物、海 洋 發(fā)酵現(xiàn)象的早期認(rèn)識 1680年制成顯微鏡 微生物的存在 1857年巴斯德證明了酒精是由活的酵母發(fā)酵 引起的 1897年 畢希納 發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍使糖發(fā)酵形 成酒精 酶 發(fā)酵工程的早期階段 人們的對發(fā)酵技術(shù)的認(rèn)識起始于 19世紀(jì)末， 主要來自于 厭氧發(fā)酵， 如利用酵母菌、乳酸 菌生產(chǎn)酒精、乳酸和各種發(fā)酵食品。 20世紀(jì)初期， 1916年英國采用梭狀芽孢 桿菌生產(chǎn)丙酮丁醇，德國采用亞硫酸鹽法生 產(chǎn)甘油（第一次世界大戰(zhàn)） 由食品工業(yè) 向非食品工業(yè)發(fā)展 好氧發(fā)酵技術(shù)： 速釀法從乙醇生產(chǎn)醋酸， 通氣法大量繁殖酵母，用米曲霉的麩曲代 替麥芽糖作糖化劑生產(chǎn)酒靖，用微小毛霉 生產(chǎn)干酪。 1933年等人發(fā)明了 搖瓶培養(yǎng)法 代替了 傳統(tǒng)的靜置培養(yǎng)法。生長均勻，增殖時間 短。 發(fā)酵工程的重大轉(zhuǎn)折 點(diǎn) 二十世紀(jì)四十年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)， 青霉素的發(fā)現(xiàn)，迅速形成工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)。 1928年由 Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素 1941年美國和英國合作對青霉素進(jìn)行生產(chǎn)研究 表面培養(yǎng)： 1升扁瓶或錐形瓶，內(nèi)裝 200mL麥 麩培養(yǎng)基 40u/ml 1943年沉浸培養(yǎng)： 5m3 200u/ml 當(dāng)今： 100m3200m 3 5 -7萬 u/ml 鏈霉素、金霉素、新霉索、紅霉素 主要的技術(shù)進(jìn)展： 通氣攪拌解決了液體深層培養(yǎng)時的供氧問題。 抗雜菌污染的純種培養(yǎng)技術(shù)：無菌空氣、培養(yǎng) 基 滅菌、無污染接種、大型發(fā)酵罐的密封與抗污染 設(shè)計制造。 意義： 抗生素工業(yè)的發(fā)展 建立了一套完整的好氧發(fā)酵技術(shù)，大型攪拌發(fā)酵 罐培養(yǎng)方法 推動了整個發(fā)酵工業(yè)的深入發(fā)展 為現(xiàn)代發(fā)酵工程奠定了基礎(chǔ) 學(xué)科發(fā)展與屬性 微生物利用工業(yè)的迅速發(fā)展 產(chǎn)生了 生化工程學(xué)科 發(fā)酵工程的三大學(xué)科基礎(chǔ) 微生物學(xué)、 生物化學(xué)及生化工程 現(xiàn)代生物技術(shù) 分子生物學(xué) 與發(fā)酵工程 20世紀(jì) 50年代： 氨基酸發(fā)酵工業(yè) 谷氨酸、賴氨酸 核酸發(fā)酵工業(yè) 肌苷酸、烏苷酸 微生物變異株通過代謝調(diào)節(jié) 代謝控制發(fā)酵技術(shù) 切斷支路代謝轉(zhuǎn)折點(diǎn) : 酶的活力調(diào)控 , 酶的合 成調(diào)控 (反饋控制和反饋?zhàn)瓒?) 解除菌體自身的 反饋調(diào)節(jié) ,特殊調(diào)節(jié)控制的利用 ,突變株的應(yīng)用 ,前體、 終產(chǎn)物、副產(chǎn)物等 20世紀(jì) 70年代 細(xì)胞融合技術(shù)、基因操作技術(shù)等生物技術(shù)發(fā)展， 打破了生物種間障礙，能 定向地制造出新的有用的微 生物 ： 增加微生物體內(nèi)控制代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的 基因拷貝數(shù) ，可 以大幅度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量 將動、植物或某些微生物特有產(chǎn)物的 控制基因 植入細(xì) 胞中，快速經(jīng)濟(jì)地大量生產(chǎn)這些產(chǎn)物 將具有不同性能的多種 質(zhì)粒 植入，使新菌株在清除污 染或以非糧食物質(zhì)為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)或環(huán)境保護(hù) 人類基因組測序完成的后向 功能基因組 學(xué) 轉(zhuǎn)變 功能基因及其表達(dá)產(chǎn)物的 獲得。 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)化技術(shù)對當(dāng)前生物技術(shù) 產(chǎn)業(yè)以及今后的潛在發(fā)展具有重要影響。 發(fā) 酵 工 程 利用微生物進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn) 效益與意義 抗生素、生物制藥、氨基酸、核苷酸、 有機(jī)酸、飼料添加劑、微生態(tài)制劑、 生物農(nóng)藥、生物肥料等 醫(yī)藥、輕工、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等行業(yè) 基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品 化學(xué)工程 生物化工 生物加工行業(yè) 傳統(tǒng)生物技術(shù) 現(xiàn)代生物技術(shù) 基因工程菌發(fā)酵 （二）發(fā)酵過程生產(chǎn)方式 發(fā)酵生產(chǎn)的基本類型 固體發(fā)酵 液體發(fā)酵 基本操作模式 沙土或冷凍保貯菌株 斜面菌種培養(yǎng) 菌體或孢子懸浮液制備 種子擴(kuò)大培養(yǎng) 發(fā)酵 發(fā)酵液處理 提取與精制 制劑制 造 成品檢驗與包裝出廠 固體發(fā)酵 將發(fā)酵原料及菌體吸附在疏松的固體支持物 （載體）上，通過微生物代謝活動，使發(fā)酵原料轉(zhuǎn) 化為發(fā)酵產(chǎn)品 淺層發(fā)酵、轉(zhuǎn)桶發(fā)酵和厚層通氣發(fā)酵 優(yōu)點(diǎn)： 設(shè)備簡單、方法簡便、能耗低、原料粗放、 不易污染、產(chǎn)物回收耗溶劑少，所生廢水少。 缺點(diǎn)： 占地面積大、勞動強(qiáng)度大、傳質(zhì)傳熱困難、 產(chǎn)率和收率低、副產(chǎn)物多、培養(yǎng)過程質(zhì)量控制難、 不適合一些復(fù)雜調(diào)控操作發(fā)酵 液體發(fā)酵生產(chǎn) 發(fā)酵原料制成液體培養(yǎng)基， 表面發(fā)酵和深層發(fā)酵 深層發(fā)酵： 菌體或菌絲體均勻分散在液體培養(yǎng)基 中，通氣或不通氣 優(yōu)點(diǎn)： 占地面積少，生產(chǎn)規(guī)模大； 發(fā)酵速度快，生產(chǎn)效率高； 生產(chǎn)機(jī)械化，易于自動化控制，勞動生產(chǎn)率高； 發(fā)酵設(shè)備緊湊，傳熱傳質(zhì)良好，生產(chǎn)便于管理； 副產(chǎn)物少，有利于產(chǎn)品提取，產(chǎn)品質(zhì)量高 類型 ：分批發(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵 分批發(fā)酵 一次性投入有限數(shù)量營養(yǎng)物，滅菌后接 種入所要培養(yǎng)的微生物，然后控制適宜的發(fā) 酵罐條件（溫度、通氣、攪拌速度、 pH等） 非恒態(tài)培養(yǎng) ，營養(yǎng)成分不斷減 少，微生物相應(yīng)生長，產(chǎn)物不斷形成 補(bǔ)料分批發(fā)酵 分批發(fā)酵中間歇地或連續(xù)地補(bǔ)加含有限制性營養(yǎng) 物的培養(yǎng)基，到某一定時間產(chǎn)物才從罐內(nèi)放出 。 優(yōu)點(diǎn)： 通過調(diào)節(jié)在發(fā)酵罐中的營養(yǎng)物濃度，可避免代謝調(diào) 節(jié)中的抑制、阻遏或毒性對生長的抑制； 可避免一次投料過多，造成細(xì)胞大量生長，溶解不 足，通氣攪拌無法適應(yīng)； 營養(yǎng)缺陷型菌的營養(yǎng)物量的控制，高效率積累產(chǎn)物； 揮發(fā)性物質(zhì)的低濃度控制； 半連續(xù)（代放）發(fā)酵 在補(bǔ)料分批發(fā)酵基礎(chǔ)上以一定的間隔時間從發(fā)酵 罐中多次放出一定體積的發(fā)酵液，直到發(fā)酵終結(jié)才全 部放出發(fā)酵液。 優(yōu)點(diǎn)： 具有補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)； 控制比生長速率使菌體代謝酶體系處于最優(yōu)； 提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力（發(fā)酵指數(shù)）； 適合于菌體生長較快的半關(guān)聯(lián)生長的次級代謝產(chǎn)物； 適用于多罐發(fā)酵車間的代放安排集中分離提取。 連續(xù)培養(yǎng) 以一定速度向發(fā)酵罐內(nèi)連續(xù)供給新鮮培養(yǎng)基的同時， 將含有微生物和產(chǎn)場的培養(yǎng)液以相同速度從發(fā)酵罐內(nèi) 放出，發(fā)酵罐內(nèi)液量維持恒定。 經(jīng)過一定時問培養(yǎng)后，培養(yǎng)物就近似于恒定狀態(tài) 的生長和代謝，這時所有物質(zhì)（營養(yǎng)物、產(chǎn)物、微生 物細(xì)胞等）的濃度、環(huán)境的物理狀態(tài)（如 pH、 DO） 以及比生長速率等始終維持不變，即穩(wěn)定狀態(tài)。 特點(diǎn)： 恒定的 生理狀態(tài)（比生長速率恒定），有利于 微生 物生理特性和遺傳特性的研究 -動力學(xué)和最適 培養(yǎng)條件的研究； 基質(zhì)在發(fā)酵罐中停留時間短，原材料轉(zhuǎn)化率低， 只能適用在生長快的微生物菌體； 在長時間培養(yǎng)過程中菌種易變異，有可能產(chǎn)生適 應(yīng)特殊環(huán)境的 負(fù)變異 菌株，而且易于染菌。 發(fā)酵過程的重要環(huán)節(jié) 菌種來源： 生產(chǎn)菌的篩選、單菌和混合菌、 篩選方案的設(shè)計、含微生物材料的選擇與預(yù) 處理、分離培養(yǎng)基、菌種的平板培養(yǎng)（不同 溫度和時間）、菌落的選擇。 菌種選育： 自然選育、誘變選育、雜交雜育、 原生質(zhì)體融合、基因工程改造、 DNA突變技 術(shù)。 培養(yǎng)基成分及來源： 碳源、氮源、無機(jī)鹽及 微量元素、前體促進(jìn)劑和抑制劑；斜面、搖 瓶、種子、發(fā)酵 純種發(fā)酵與無菌技術(shù)： 培養(yǎng)基滅菌、無菌 空氣、密閉設(shè)備與罐壓、無污染接種 種子擴(kuò)大培養(yǎng)： 一級或多級種子制備、種 子質(zhì)量控制 發(fā)酵工藝控制： 溫度、通氣量、攪拌、消 泡沫、 pH、 DO、培養(yǎng)基配比、菌絲形態(tài)、 放罐時間、接種量、其他各種操作 發(fā)酵罐與計算機(jī)控制： 通氣、攪拌、密閉、 各種高級控制 輔助設(shè)備 公用系統(tǒng)： 空壓房、冷凍設(shè)備、鍋爐房、 水系統(tǒng)、污水處理、發(fā)電廠 原材料倉庫與配料間： 后提取車間與成品倉庫： 菌種保存與種子制備實(shí)驗室： 中間分析實(shí)驗室： 發(fā)酵車間設(shè)計 工藝流程： 菌種、種子培養(yǎng)、發(fā)酵、控制條 件（溫度、時間、）、技術(shù)水平 設(shè)備平衡： 生產(chǎn)能力、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)、技術(shù)指標(biāo)、 設(shè)備平衡計算 車間設(shè)計： 平面與立面布置、管路設(shè)針 廠區(qū)設(shè)計： 風(fēng)向、綠化、人流與物流、生 活區(qū)與工廠區(qū) 人員崗位與運(yùn)行管理設(shè)計： 基建及施工設(shè)計： （三）發(fā)酵工程研究的主要現(xiàn)狀和問題 提高產(chǎn)品的市場競爭能力，降低成本，提高 產(chǎn)品質(zhì)量 ： 控制不同的操作條件時，有完全不 同的產(chǎn)量和質(zhì)量結(jié)果 優(yōu)化 從小罐放大到生產(chǎn)罐，有很大差異， 可能要失敗 放大 菌種選育 基因工程菌的構(gòu)建 忽視了生物反應(yīng)器中 工程問題 所必 須加以考慮的工藝變化和過程優(yōu)化。 采用人工經(jīng)驗為主的靜態(tài)操作 背景 過程優(yōu)化 發(fā)酵過程計算機(jī)控制 傳感器： DO、 pH、 排氣成份分析系統(tǒng) 計算機(jī)控制系統(tǒng)： 單片智能 、 工控機(jī) 、 pLC 、 DCS 執(zhí)行器件： 杯式補(bǔ)料系統(tǒng) 參數(shù)自動控制回路 溫度 自動控制；通氣流量自動控制；罐壓自動控制 pH調(diào)節(jié)（手控或自控）； DO與轉(zhuǎn)速、通氣流量程序 串級調(diào)節(jié) 背景 發(fā)酵工程控制 “ 內(nèi)部控制 ” ： 如何改變細(xì)胞的遺傳組成 和 “ 發(fā)酵工程控制 ” 細(xì)胞的代謝生理特性 “ 外部控制 ” ： 物理和化學(xué)環(huán)境條件控制 外部控制是基于內(nèi)部控制調(diào)節(jié)，但是在研究和過渡的方法上 又是不同的。 生化工程所面臨的任務(wù) 就是在 已 提供高產(chǎn)菌株 的基礎(chǔ)上，如何把這些高 產(chǎn)菌種在培養(yǎng)過程中進(jìn)一步考察它的 生理生化特性 ，穩(wěn)定 或改進(jìn)微生物反應(yīng)工藝過程，這里不僅要求對生物物性的 動態(tài)有詳盡的了解，對生化反應(yīng)做定量的和動力學(xué)方面的 考察，還需具有 工程學(xué)的技巧 ，才能充分發(fā)掘和利用生物 體系的潛力。 另一方面，計算機(jī)技術(shù)的高度發(fā)展也在客 觀上為分析和優(yōu)化控制這種復(fù)雜的發(fā)酵過 程提供基礎(chǔ)，因此，借助于 計算機(jī)系統(tǒng) 對 發(fā)酵過程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析和控制就愈 來愈成為人們的迫切要求 。 生理生化特性 微生物生長和反應(yīng)過程研究 微生物的生長反應(yīng)特性是發(fā)酵過程優(yōu)化的最重要的出發(fā)點(diǎn)。 基質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞、胞內(nèi)反應(yīng)、代謝產(chǎn)物的胞內(nèi)外分泌等全過 程進(jìn)行分析 胞內(nèi)反應(yīng)中分解代謝、合成代謝和大分子物質(zhì)合成之間的 物質(zhì)和能量的關(guān)系 發(fā)酵過程的化學(xué)計量學(xué)和熱力學(xué)研究 經(jīng)過 1000多步胞內(nèi)反應(yīng)才能轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn) 物和細(xì)胞成分，一般把細(xì)胞看作一個開放的 黑箱系統(tǒng) 化學(xué)計量學(xué) 主要研究有關(guān)發(fā)酵過程中反應(yīng) 組分組成變化的規(guī)律，把生物反應(yīng)器中微生 物細(xì)胞活動用化學(xué)元素的平衡式來表示 熱力學(xué) 研究只強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)的起始態(tài)和終止態(tài)， 給出反應(yīng)可能進(jìn)行到的最大程度。在發(fā)酵 工程中常以得率系數(shù)概念 Yi/j對各種基質(zhì)形 成菌體或產(chǎn)物的潛力進(jìn)行評價 微生物反應(yīng)動力學(xué)與生物反應(yīng)工程 微生物反應(yīng)動力學(xué)是發(fā)酵過程優(yōu)化研究的核心內(nèi)容， 主要研究生物反應(yīng)的速率及其影響因素 通過基質(zhì)消耗、細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成的數(shù)學(xué)描述，反 映微生物系統(tǒng)的狀態(tài)特征 提出了許多數(shù)學(xué)模型：經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀C(jī)理模型；統(tǒng) 計模型和非統(tǒng)計模型；結(jié)構(gòu)模型和非結(jié)構(gòu)模型 實(shí)際發(fā)酵過程是在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，這就是 宏觀動力學(xué)研究，逐漸發(fā)展成生物反應(yīng)工程 數(shù)學(xué)模型 靜態(tài)和動態(tài)優(yōu)化 系統(tǒng)識別 自適應(yīng)控制 專家系統(tǒng) 、 模糊控制 、 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 各種混沌現(xiàn)象的研究 實(shí)際工廠生產(chǎn) 效果不明顯 背景 現(xiàn)代控制理論的應(yīng)用 數(shù)學(xué)模型 靜態(tài)和動態(tài)優(yōu)化 系統(tǒng)識別 自適應(yīng)控制 專家系統(tǒng) 、 模糊控制 、 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 各種混沌現(xiàn)象的研究 實(shí)際工廠生產(chǎn) 效果不明顯 過程放大 因次分析法 經(jīng)驗法則法 數(shù)學(xué)模擬法 時間常數(shù)法 幾何相似 流體運(yùn)動學(xué)相似 流體動力學(xué)相似 同時滿足這些相似條件是不可能的 當(dāng)在小試研究時某一個對生產(chǎn)產(chǎn)生影響的重 要因素設(shè)有被觀察到，而這個因素恰恰在放大時 成為關(guān)鍵因子時，就會造成整個發(fā)酵過程的失敗。 背景 微生物學(xué) 生物化學(xué) 分子生物學(xué) 發(fā)酵工藝學(xué) 化學(xué)工程 現(xiàn)代控制理論 各種工程開發(fā) 參數(shù)檢測 (自動或手工檢測 ) 綜合性研究： 定性和定量的措述 工業(yè)生產(chǎn) 生化工程傳感器與計算機(jī)數(shù)據(jù)處理作為一個獨(dú)立的 技術(shù)領(lǐng)域被人們重視 在線計算機(jī) 多學(xué)科發(fā)展與綜合 仍舊局限于尋求培養(yǎng)基配方和最佳的溫度 、 pH、 DO等 缺乏微觀的實(shí)時的代謝調(diào)控 代謝調(diào)控研究 代謝工程研究 發(fā)酵過程酶學(xué) 研究的困難 過程數(shù)據(jù)采集 和處理的困難 發(fā)酵工藝優(yōu)化研究 的基本思路 發(fā)酵罐 測量參數(shù)及其變化的意義缺乏理解 最佳工藝控制點(diǎn)為依據(jù)的靜態(tài)操作 方法 ， 只是化學(xué)工程宏觀動力學(xué)概 念在發(fā)酵工程上的簡單延伸 ， 缺乏以細(xì)胞代謝流分析與控制為核 心的研究內(nèi)容 背景和原理 發(fā)酵過程優(yōu)化與放大仍是 一個令人困惑的問題 ？ 對于活體細(xì)胞調(diào)控來說，采用傳統(tǒng)的 生物學(xué)方法或化學(xué)工程的 調(diào)控 方法，存在 很大的問題，國內(nèi)外都沒有很好解決 。 背景 三、發(fā)酵舉例 制造微生物生物量 PHB發(fā)酵 黃原膠發(fā)酵 二元酸發(fā)酵 丙酮酸發(fā)酵 乙醇發(fā)酵 Vc發(fā)酵 制造微生物生物量 單細(xì)胞蛋白 假絲酵母 (Candida sp.)等 面包酵母 釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 微生物肥料 根瘤菌 (Rizobium sp.) 微生物農(nóng)藥 蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis) 三次采油 解烴棒桿菌 (C.hydrocarboclastus) 等 環(huán)境治理 芽孢桿菌 (Bacillus sp.)等 卡介苗 無毒結(jié)核分枝菌 (Mycobacterium tuberculosis) PHB發(fā)酵 (glycolysis) Glucose pyruvate acetyl-CoA TCA 3-ketothiolase acetate acetoacetyl-CoA reductase R-(-)-3-hydroxybutyryl-CoA PHA synthesis 氮源限制 PHB 黃原膠發(fā)酵 野油菜黃單胞菌（ Xanthomonas campestris）產(chǎn) 生的胞外多糖，發(fā)酵液粘度可達(dá) 7000cp 非牛頓型發(fā)酵 二元酸發(fā)酵 CH3(CH2)nCH3 -oxidation CH3(CH2)nCOOH CH3(CH2)n-2COOH -oxidation HOOC(CH2)nCOOH 水 、 油 、 氣 、 固多相反應(yīng) -氧化與 -氧化 丙酮酸發(fā)酵 Glu Lat Pyr EtOH TCA 營養(yǎng)（維生素、氨基酸）限制 溶氧控制 乙醇發(fā)酵 產(chǎn)物抑制問題 原料成本問題 Vc二步法發(fā)酵 弱氧化醋桿菌 “ 大、小 ” 菌混合 山梨醇 山梨糖 2-酮基 -L-古龍酸 丙酮丁醇發(fā)酵 丙酮丁醇是良好的有機(jī)溶劑機(jī)合成工業(yè)的重要原 料。 1861年 巴斯德 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能產(chǎn)生丁醇。 1866年英 國最早用 丁二烯 作為合成橡膠的原料加速了丙 酮丁醇工業(yè)的商品化生產(chǎn)。 1908 1911年汽車工 業(yè)需要橡膠，制造人造橡膠的丙酮丁醇需要量大 增。 1914年 Chain Weizmann分離到丙酮丁醇菌， 丙酮丁醇產(chǎn)量提高 4倍，使該行業(yè)開始進(jìn)入 工業(yè)發(fā) 酵 生產(chǎn)階段。 1916年在第一次世界大戰(zhàn)期間，丙酮用于 制造無煙火藥，需量劇增，于是著手研究 發(fā)酵法 生產(chǎn)的改進(jìn)，直到 1930年完成生產(chǎn) 工藝。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇一直是當(dāng)時的 主要方法。 1960年后，由于以石油為原料的 化學(xué)合成 丙酮丁醇更經(jīng)濟(jì)，美國和其它一些國家相 繼停止了發(fā)酵生產(chǎn)。我國現(xiàn)在是兩種方法 并用。 一、 丙酮丁醇的生產(chǎn)方法 (一 )合成法 例如，用稀酒精催化制丙酮， 用石油氣中的丙烯制成 異丙醇 ，再經(jīng) 氧化 脫氫 制丙酮；用丙烯與苯制成異丙苯，再 氧化制丙酮及苯酚。丁醇的合成有 乙醛縮 合加氫 、丙烯羧化加氫和乙醇直接合成丁 醇等。（如下式） (二 )發(fā)酵法 和酒精發(fā)酵 樣，以淀粉質(zhì)、 紙漿廢液、糖蜜和野生植物等為原料，利 用丙酮丁醇菌所分泌的 酶 來分解淀粉成糖 類再經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)變化，生成丙 酮、丁醇和乙醇等產(chǎn)物，同時還產(chǎn)生大量 的 CO2棚 H2等副產(chǎn)品。 二、 淀粉質(zhì)原料的丙酮丁醇發(fā)酵 丙酮丁醇菌在廣義上屬于 丁酸菌族 。丁酸 菌是嫌氣性的，有鞭毛，能運(yùn)動的桿 菌在產(chǎn)生孢子時成為紡錘狀或鼓槌狀。 細(xì)胞內(nèi)含有淀粉拉，能被碘液染成深藍(lán)色。 丙酮丁醇菌除具有丁酸菌的通性外，還具 有能發(fā)酵產(chǎn)生丙酮、丁醇等中性產(chǎn)品的能 力。 在中性培養(yǎng)基中發(fā)酵時，一般丁酸菌和丙 酮菌均能產(chǎn)生 丁酸和醛酸 、當(dāng)培養(yǎng)基的酸 度增加到一定數(shù)值后，一般丁酸菌即停止 發(fā)酵，并且菌體的繁殖也停止但是丙醇 丁醇菌則不然，當(dāng)培養(yǎng)基的 酸度達(dá)到最高 點(diǎn) 后，由于有脫羧能力，酸度反而下降， 并且產(chǎn)生中性的產(chǎn)品 -丙酮、丁醇 、乙 醇等 (圖 3 1)。 由于丙酮丁醇菌的上述持性，為區(qū)別于 般丁酸菌，將能引起丙酮、丁醇發(fā)酵的細(xì) 菌命名為 丙酮丁醇菌 。幾種與丙酮丁醇茵 類似的梭菌簡述如表 3 1。 (1)丙酮丁梭菌 ：能發(fā)酵玉米、馬鈴薯等淀粉質(zhì)原 料和蔗糖等糖質(zhì)原料而產(chǎn)生溶劑， CO2， H2和少 量有機(jī)酸。溶劑的比例為： 6份丁醇 3份丙酮： 1 份乙醇，即 B： A： E 6:3:1，不同的變異株有不 同的比例數(shù)。 發(fā)酵溫度為 35-36 用玉米發(fā)酵時玉米濃度為 5 一 8，用馬鈴薯時，發(fā)酵醪中鮮馬鈴薯量為 20 ，在 48 60 h就可以發(fā)酵結(jié)束。 二、 淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇的流程 三、種母的培養(yǎng)與制備 (一 ) 丙酮丁醇菌的分離與純化方法 在土壤、細(xì)泥、糞便中及新鮮果實(shí)、蔬菜的表面 上均有丙酮丁醇菌存在。利用它的孢子的嫌氣 性和耐熱性，可以采用熱淘汰法和單細(xì)胞分離 法以獲得優(yōu)良的菌種。 由于丙酮、丁醇發(fā)酵時，易受雜菌侵染而導(dǎo)致酸 敗所以，丙酮丁醇工廠須經(jīng)常進(jìn)行菌種的分離 與純化工作，以保證正常生產(chǎn)。 所謂 熱淘汰法 ，即將含有丙酮丁醇菌的試 樣接入 5的玉米醪試管內(nèi)再放在沸水浴 中 1-1 5min，殺死不耐熱的雜菌和熱抵抗 力較差的孢子，而保留對熱抵抗力較強(qiáng)的 丙酮丁醇菌孢子，然后在爆氣狀態(tài)下培養(yǎng)。 培養(yǎng)液產(chǎn)生大量氣體，這時可轉(zhuǎn)接到新鮮 培養(yǎng)基試管內(nèi)，同法進(jìn)行熱淘汰和嫌氣培 養(yǎng)，如此反復(fù)多次，即可獲得較好的菌株。 欲獲得 純培養(yǎng) 或者需從發(fā)酵醪中選取優(yōu)良 菌株，可用嫌氣平板進(jìn)行單菌落分離。如 用有明膠或碳酸鈣的培養(yǎng)基，則可能出現(xiàn) 溶解圈 。然后接入玉米醪中測定氣體產(chǎn)生 量和丙酮產(chǎn)量。獲得的優(yōu)良菌種用沙土管 保存。 1 試管菌種的培養(yǎng) ：選取優(yōu)良菌種的砂土孢子 1 2g，接入 10 m l 5濃度的玉米醪中，并將此管在 100 C沸水中熱處理 1 2 min，急速冷卻至 37 然后置于真空干燥器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng) (2666 Pa 以下溫度保持在 37 39 )。 2種母瓶培養(yǎng) ：將一支試管菌種接種到盛有 5濃度的玉米醪液的種母瓶中，在常壓下 培養(yǎng) 24h，即可接入第一種母瓶。一船丙酮 丁醇菌孢子萌發(fā)時，要求嫌氣條件較高， 營養(yǎng)體繁殖時，由于本身產(chǎn)生的 H2和 CO2 已能滿足嫌氣條件。 3第一種母罐 ：其中盛有 6濃度的玉米 醪接入種母瓶的醪液培養(yǎng) 12一 15h后，即 可按入第二種母罐。 4第二種母罐 ：其中盛有 8濃度的玉米 酵，接入第一種母罐酵液，培養(yǎng) 20 h左右， 然后將總量 l 3一 1 2送入發(fā)酵罐。 制備種醪的方法有間歇調(diào)制種醪法，半 連續(xù)調(diào)制種酵法，利用部分發(fā)酵醪制種醪 法。 四、發(fā)酵 (一 )發(fā)酵醪制備 目前國內(nèi)都以 8玉米粉作 發(fā)酵酵。原料經(jīng)粉碎蒸煮即可。蒸煮發(fā)酵 醪時常加入一定量的廢醪 (10-25%)，這不 僅增加部分營養(yǎng)，而且降低粘度。蒸煮過 程也是滅菌 過程，因而蒸煮多以高溫連續(xù)蒸煮為主 (方 法同酒精發(fā)酵 )然后 冷卻進(jìn)入發(fā)酵罐，制備好的種醪也從種母 罐同時流入發(fā)酵罐。 (二 )發(fā)酵過程生化變化 發(fā)酵過程通常經(jīng)過 三個階段，即前發(fā)酵期、主發(fā)酵期和后發(fā) 酵期，整個發(fā)酵過程經(jīng) 40一 72h結(jié)束。 1前發(fā)酵期 ：主要為 種菌 繁殖期。細(xì)胞數(shù) 激增，酸度增加，所以又稱為增酸期，由 于丙酮丁醇菌細(xì)胞活動的結(jié)果，也產(chǎn)生少 量的溶劑，主要的發(fā)酵產(chǎn)品為 醛酸、丁酸、 氫氣、二氧化碳等。 此時 淀粉 的消耗量為 30左右，丙酮丁醇菌和 其它細(xì)菌不同，它所需的誘發(fā)期很短，很快即 可增殖，通常前發(fā)酵期為開始發(fā)酵后的 15 18h。 2 主發(fā)酵 期：丙酮丁醇菌已能旺盛發(fā)揮它的發(fā) 酵特性，將前一階段產(chǎn)生的醋酸、丁酸等變?yōu)?丙酮、丁醇 等溶劑的階段 在此階段氣體發(fā)生量達(dá)到最高蜂，溶劑生 成很快，酸度下降至原有酸度的 1 2左右， 所以又稱 減酸 期，此時期在 18 40 h后。 3 后發(fā)酵 期：酸度達(dá)最低后，又稍為上升，維 持 定水平至發(fā)酵結(jié)束，所以又稱酸度復(fù)升期。 此時所積聚的酸主要為不揮發(fā)酸，揮發(fā)酸量和溶 劑也稍有增加，但是由于丙酮丁醇菌在此時期開 始自溶，以及部分丙酮丁醇菌產(chǎn)生孢子所以活 動的丙酮丁醇菌逐漸減少，發(fā)酵逐漸衰弱以至結(jié) 束。此時期在 40一 70 h。 (三 )發(fā)酵的方法 有間歇發(fā)酵法 (包括一次加料法、分次流加 法 )串聯(lián)式發(fā)酵法相連續(xù)發(fā)酵法，目前多采 用 串聯(lián) 法和 連續(xù)發(fā)酵 法。 (四 )影響發(fā)酵的主要因素 1 溫度 ：最適發(fā)育溫度為 36 37 。正 常生長時期最高溫度為 40 左右，有試驗 表明，當(dāng)發(fā)酵溫度增高時溶劑產(chǎn)量降低， 殘余糖量增加。 2培養(yǎng)基的 PH值 ：培養(yǎng)基 中性 時，丙酮丁 醇菌具有使淀粉發(fā)酵成丁酸、醋酸等的能 力，而使 pH下降，而在 酸性 培養(yǎng)基中具有 將醋酸、丁酸變?yōu)楸〈嫉哪芰Γ?丁醇菌繁殖的最適 pH值為 5.5 7.0。 3培養(yǎng)基的 氧化還原值 ：丙酮丁醇菌是嫌 氣菌。氧對它有毒害作用。嫌氣條件不僅 和氧有關(guān)，而且更和培養(yǎng)基的氧化還原值 有關(guān)。 通常 rH2 7 9能正常發(fā)酵，當(dāng) rH2向氧化 方面變動為 10 2時則不能進(jìn)入第二階段 發(fā)酵；當(dāng) rH2再大時，菌種不僅不能發(fā)育而 且逐漸死亡。 當(dāng) PH低于 4或高于 8時，細(xì)菌的繁殖完 全停止，不同的生長階段有所不同， 第一階段 pH值可以較高，如果開始 pH 過低，丙酮丁醇菌會生長不良，在發(fā) 酵第二階段，最適 PH值下降為 4 3 5 3較適合。 丙酮丁醇菌因為發(fā)酵時能產(chǎn)生 氫氣、 CO2， 所以，只要開始發(fā)酵時能建立嫌氣狀態(tài)， 以后則由于培養(yǎng)基繼續(xù)為放出的氫和 CO2 所飽和，就能阻止空氣中氧氣入內(nèi)，并且 醪液是膠狀物，培養(yǎng)基的粘度和固體顆粒 對造成嫌氣條件也有幫助。 4醪液與發(fā)酵產(chǎn)物濃度 ：丙酮丁醇菌雖然 能產(chǎn)生丙酮丁醇，但如果醪液中丙酮丁醇量 過高 時，對菌本身有 毒害 。所以丙酮丁醇 發(fā)酵時所采用的醪液濃度 般為 8一 10 。 在發(fā)酵醪內(nèi)溶劑的最高濃度只能達(dá)到 25g/L(2 5 )。其中包括丙酮 0.85丁 醇 1.5，乙醇 0.15。發(fā)酵醪中丁醇量如 超過 1 5，對丙酮丁醇菌則有 抑制 作 用因此丙酮丁醇發(fā)酵時，醪液的濃度需 要配合菌種能忍耐溶劑的濃度來決定。 其它如發(fā)酵時產(chǎn)生的 糠醛 ，原料中的 單 寧 等對發(fā)酵都有一定影響。 三、 如何提高溶劑產(chǎn)量 為了增強(qiáng)發(fā)酵法的競爭力，提高溶劑產(chǎn)量是 根本任務(wù)。 1菌種選育。 由于菌本身受溶劑的影響 很大，特別是丁醇的濃度，在發(fā)酵液中一般 達(dá)到 1% 時，即為致命的水平 (丙酮的毒性較 低，一般菌能耐 2.9的濃度 )因此，溶劑 產(chǎn)量的高低往往與菌株對 丁醇的耐力 有關(guān)。 在丁醇的存在下，采用常規(guī)的誘變手段 (如 亞硝基胍 )，可以獲得一定量的高產(chǎn)菌株。 現(xiàn)發(fā)現(xiàn)耐丁醇的突變株與野生型菌株的細(xì) 胞膜 類脂成分 有所不同。 當(dāng)野生型菌株的生長進(jìn)入穩(wěn)定期時，不飽 和脂肪酸的百分率與飽和脂肪酸百分率比 值的增加是一致的，可是耐丁醇菌株，在 同一時期在這 比率上呈現(xiàn)出明顯的變化， 即 不飽和脂肪酸 的比例隨時間延長而增加。 這表明，通過合成不飽和脂肪酸，耐丁醇 的突變株可建立起一種補(bǔ)償由丁醇引起 膜 流動效應(yīng) 的機(jī)制，它使得微生物維持在 種等粘度的膜狀態(tài)。 Westhuizem等人曾報道丙酮丁醇梭菌 (1yt-1）的不產(chǎn) 自溶素 突變株比親本菌株 (P262)更抗丁醇，說明耐丁醇和自溶素活 力間有一定的相關(guān)性對于丙酮丁羧菌的基 因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)也做了各種基礎(chǔ)研究，尚有很 多難點(diǎn) 未能突破 ，如外源 DNA難于進(jìn)入丙 酮丁醇菌內(nèi)，沒有合適的用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的克隆 載體 等。 2發(fā)酵過程中， 加入乙酸和丁酸 的作用。 有一試驗表明，在正常的培養(yǎng)基中，于接 種后和培養(yǎng) 24h后加入 2g/L和 5g/L或 2g/L的 乙酸和丁酸，其效果見表 3 2。 從表 3 2中可以看出，接種后加入 2g/L的乙 酸 ，可增加丙酮的形成總?cè)軇┻_(dá) 23 4， 并使糖的轉(zhuǎn)化率從 32 4提高到 34 1。 加入 2g L丁酸 ，則增加總的溶劑量，糖轉(zhuǎn) 化率達(dá) 35 1。同時加入合適濃度的 乙酸 和丁酸 ，總?cè)軇┻_(dá)到 24.7g L，丁醇與丙酮 的比為 2。 3消除培養(yǎng)液內(nèi)還原性化合物，如用真空法、通 氯法等消除氫氣，有利于提高產(chǎn)量。 4培養(yǎng)液 適當(dāng)?shù)奶嫉?是獲得正常的溶劑產(chǎn)量的 關(guān)鍵，高與低的比例均非適宜。 5消除溶劑對菌的抑制作用，如加蓖麻油活性 炭、多種聚合樹脂等的吸附發(fā)酵；加入油醇等的 萃取發(fā)酵； 不斷的移去產(chǎn)生的溶劑 ， 不斷的補(bǔ)加 碳源 (見圖 3 2)。 7 固定化細(xì)胞 的溶劑生產(chǎn)。例如，可以用海 藻酸鈣固定菌細(xì)胞或孢子以 N2維持嫌氣和無菌。 固定的營養(yǎng)細(xì)胞如果處于溶劑產(chǎn)生期，在整個延 續(xù)期間，溶劑會連續(xù)產(chǎn)生。 固定化孢子可以避免細(xì)胞代謝活動的干擾。在 膠體內(nèi)的活性細(xì)胞充分生長后，能夠恢復(fù)高生產(chǎn) 能力，結(jié)果表明連續(xù)生產(chǎn)完全可能。固定化細(xì)胞 的 丁醇產(chǎn)率 比常規(guī)的分批工藝要高得多。 四、 溶劑產(chǎn)生的調(diào)節(jié) 最近實(shí)驗的結(jié)果有助于更好理解培養(yǎng)基組 成對丙酮丁醇菌的影響。未解離的丁酸似 乎是調(diào)節(jié)溶劑產(chǎn)生的主要因子，圖 3 3推 斷菌體生長和代謝受 本身代謝物 調(diào)節(jié)的示 意圖。未解離的丁酸抑制細(xì)胞生長和產(chǎn)酸， 同時啟動丁醇的產(chǎn)生。 NH4+ 激活細(xì)胞生 長和產(chǎn)酸，但過剩的氮抑制溶劑的產(chǎn)生。 分批發(fā)酵中，未解離的丁酸濃度在 0.2- 0.4g/L，即出現(xiàn)抑制生長和產(chǎn)酸 。未解離 酸濃度達(dá) 0 5 1 5g/L時，自然的會啟動 溶劑的產(chǎn)生。如達(dá)不到 臨界酸濃度 (可能 pH 太高或初糖濃度太低 )溶劑就不會形成。 連續(xù)發(fā)酵處于平穩(wěn)狀態(tài)時，即使很低的酸 濃度，溶劑也能產(chǎn)生。