大黃素對白蛋白誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響

,大黃素對白蛋白誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響,主講：房向東,The effect of Emodin on the human renal tubular epithelial to mesenchymal transition induced by albumin,概 要,蛋白尿不僅僅是腎臟損傷的生物學(xué)標(biāo)志，還是加速腎臟疾病向終末期腎衰進展的主要危險因素之一。,研究背景,腎臟損傷,蛋白尿,臨床表現(xiàn),反作用,物理損傷,誘導(dǎo)化學(xué)趨化因子、炎癥因子,激活補體,促進細胞凋亡,損傷及加速纖維化機制,病理變化,腎臟纖維化,研究背景,腎臟纖維化,腎間質(zhì)纖維化是關(guān)鍵！,間質(zhì)纖維化的程度更能預(yù)測腎功能的變化！,研究背景,腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化（TEMT） 在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，它被定義為腎小管上皮細胞丟失了上皮表型，而獲得新的肌成纖維細胞特征的過程。,研究背景,上皮細胞,肌成纖維細胞,化學(xué)名：3-甲基-1，3，8-三羥基蒽醌,大黃素,傳統(tǒng)的生物學(xué)作用：抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制、保肝、護腎,研究背景,體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)大黃素可延緩糖尿病腎病、梗阻性腎病等腎臟纖維化發(fā)生，其中阻滯TEMT過程發(fā)揮重要地位。,研究背景,研究目的,白蛋白能否誘導(dǎo)HK-2細胞轉(zhuǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)分化過程 、促進細胞外基質(zhì)合成,大黃素對白蛋白產(chǎn)生的上述過程是否產(chǎn)生影響,技術(shù)路線與分組,空白對照組,大黃素對照組,大黃素干預(yù)組,白蛋白誘導(dǎo)組,HK-2細胞,無處理因素,20g/ml大黃素作用0、12、24、48h,5mg/ml白蛋白刺激時同時加入20g/ml 大黃素作用0、12、24、48h,觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化，收集細胞總RNA半定量檢測-SMA、E-cadherin、FNmRNA的表達,5mg/ml白蛋白作用0、12、24、48h,各組實驗重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以xs表示，行方差齊性檢驗，多組間計量資料采用單因素方差分析 用SPSS12.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理 以P0.05為有顯著性差異, P0.01有非常顯著性差異,統(tǒng)計方法,RT-PCR,正常HK-2細胞僅表達少量的-SMA、FNmRNA， 而E-cadherinmRNA的表達較強。,E-cadherin,-SMA,FN,M 0 12 24 48h,大黃素對照組上述因子的表達與正常對照組無差異,結(jié) 果,白蛋白可誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，即E-CadherinmRNA的表達下調(diào)， -SMAmRNA的表達上調(diào)，與0h比較，12h后即有差異，48h后差異顯著， p0.01。而同時加入20g/ml大黃素作用后，其變化趨勢明顯減弱。,-SMA,白蛋白誘導(dǎo),大黃素干預(yù),M 0 12 24 48h,結(jié) 果,白蛋白誘導(dǎo)HK-2細胞表型轉(zhuǎn)化及大黃素干預(yù)后的效果,E-cadherin,大黃素干預(yù),白蛋白誘導(dǎo),M 0 12 24 48h,M 0 12 24 48h,白蛋白誘導(dǎo)HK-2細胞分泌纖維連接蛋白（FN）的情況及大黃素干預(yù)后的效果,FN的表達隨白蛋白刺激時間延長而逐漸增多，在大黃素干預(yù)后其表達上調(diào)趨勢亦明顯減緩。,FN,白蛋白誘導(dǎo),大黃素干預(yù),M 0 12 24 48h,討 論,蛋白尿與腎小管間質(zhì)損傷,蛋白尿的水平反映了腎小球損傷的程度 MDRD試驗 把蛋白尿基礎(chǔ)排出量作為獨立的危險因素納入加速慢性腎臟病進展的研究 臨床研究發(fā)現(xiàn)CKD患者在應(yīng)用 ACEI、ARB類藥物可非依賴降壓作用減少尿蛋白量的排泄而延緩慢性腎臟病惡化速度 降尿蛋白和延緩GFR下降之間有著緊密的聯(lián)系，蛋白尿的程度對CKD預(yù)后具有很強的預(yù)測價值 。,討 論,蛋白尿與腎小管間質(zhì)損傷,我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5mg/ml人純化白蛋白刺激HK-2細胞一段時間內(nèi)后，上皮細胞表型標(biāo)志物E-cadherinmRNA表達下調(diào)，肌成纖維細胞表型物-SMAmRNA表達上調(diào)，且隨白蛋白作用時間的延長表達水平逐漸增強。 結(jié)果表明HK-2細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，介導(dǎo)了腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。,討 論,TEMT與腎小管間質(zhì)纖維化,TEMT在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用 TEMT過程包括：腎小管上皮細胞的黏附屬性缺失(E-鈣粘蛋白減少)，腎小管基底膜的破壞，表達-SMA的肌成纖維細胞增多及其向間質(zhì)遷移最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化。 。,腎間質(zhì)纖維化的另一決定因素是ECM合成與降解平衡的調(diào)節(jié) 肌成纖維細胞分泌FN參與ECM構(gòu)成。 本研究選擇FN作為觀察ECM聚積的評價指標(biāo),TEMT與腎小管間質(zhì)纖維化,討 論,我們實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常腎小管上皮細胞因未發(fā)生明顯轉(zhuǎn)分化，其FNmRNA的分泌甚微， 而5mg/ml人白蛋白誘導(dǎo)HK-2細胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生同時，檢測到FNmRNA表達呈現(xiàn)時間依賴性增強，進一步參與腎間質(zhì)纖維化的形成。,TEMT與腎小管間質(zhì)纖維化,討 論,討 論,大黃素阻滯TEMT在腎間質(zhì) 纖維化中的作用,實驗中，我們通過使用20g/ml大黃素與白蛋白共同作用HK-2細胞制造干預(yù)模型。 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大黃素干預(yù)后HK-2細胞后其E-cadherinmRNA的表達亦有漸降趨勢，-SMA mRNA表達上升，但在48h內(nèi)其下降/上升趨勢呈明顯減緩，較白蛋白誘導(dǎo)組有明顯差異。 大黃素部分阻滯了HK-2細胞的TEMT過程。,討 論,大黃素阻滯TEMT在腎間質(zhì) 纖維化中的作用,而通過對FNmRNA表達情況的檢測發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大黃素干預(yù)后，F(xiàn)NmRNA表達亦受到部分抑制。 原因可能為：1、大黃素阻滯了HK-2細胞的轉(zhuǎn)分化發(fā)生，使得Myof細胞生成減少，進而減少了FN的表達和分泌來源；2、大黃素可抑制Myof細胞對FN的表達和分泌過程。,結(jié)論,thanks,