大豆蛋白的提取與含量測定

大豆蛋白的提取與含量測定,指導老師 徐文俊,序言蛋白質化學實驗,蛋白質是一切生物體內重要的組成成份，蛋白質是由二十多種氨基酸以肽鍵相互聯接而成的復雜的高分子化合物，溶于水時形成親水膠體溶液。在酸堿和酶的作用下，蛋白質被水解成膠胨肽最后形成氨基酸。 蛋白質分子依靠氫鍵、鹽鍵等副價鍵維持一定的空間構型。在各種物理化學因素影響下，由于副價鍵的破裂，使其空間結構遭受不同程度的破壞，蛋白質的物理化學性質和生物學活性也隨著改變。該現象稱為蛋白質的變性。,蛋白質分子是含有酸性基團和堿性基團的兩性電解質，在等電點時，蛋白質分子的酸性基團和堿性基團的解離度相等，成為帶有正負電荷相等的兩性離子，在電場中不向兩極移動，并且極易沉淀。氨基酸組成不同的蛋白質，具有不同的等電點。根據在一定條件下（如PH，離子強度等）它們所帶電荷的數量和種類，分子的大小及形狀等方面的差異，可以采用電泳，離子交換柱層析等方法對它們進行分離分析。 許多物理化學因素可以改變蛋白質在水中的溶解度，產生可逆或不可逆沉淀，這些因素（如增加溶液的離子強度，降低溶液的介電常數，調節(jié)溶液的PH等）以及一些沉淀劑和膠附劑也常用來分離，提純蛋白質或除去蛋白質。為了更好地使同學們運用和掌握好理論和實踐相結合，把學到的理論應用到實驗中，本系列實驗安排是從一種生物中提取蛋白質，通過各種物理化學性質使其得到純化，得到蛋白質，并進行濃度測定，計算其收率。,蛋白質性質與應用技術關系圖,肽 氨基酸,疏水性 親水性,低 層 析,一、大豆蛋白的提取,目的要求 1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、計算粗提產率 2、學習計算蛋白質收率 實驗原理 大豆中含有豐富的蛋白質、根據其性質不同，可以分為水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白、堿溶蛋白。將豆粉依次用上述溶劑提取，并用有機溶劑沉淀，可制得各部分蛋白質的干粉。本實驗主要是水溶提取大豆蛋白。 稱出提出蛋白質的重量，已知原料重量，可以求出蛋白質的收率。,試劑和器材,1、試劑 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL （5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH 2、器材 （1）離心機 （2）燒杯 （3）滴管 （4）PH試紙等,操作方法,1、水抽提 將豆粉5g用約40毫升左右的蒸餾水少量多次的添加攪拌，常溫下攪拌抽提15min， 3800r/min離心15min，取上清液，如上清液不清澈再經過濾。 取上清液1毫升稀釋50倍留做蛋白測定。 其余清液加入等體積在冰箱中預冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（攪拌）6mol/L和1 mol/L HCL，調PH4.55.0，3800r/min，離心15min，收集沉淀物，反復用丙酮攪拌洗滌離心2次，得到粉末狀蛋白質干粉，稱重，計算粗產率。,蛋白質產物重量 蛋白質產率= 100% 原料總重量 思考題 1、用丙酮沉淀蛋白時，為何要調PH4.55.0？ 2、大豆中哪類蛋白含量最多？ Folin酚法測定蛋白質濃度見第二實驗部分,Folin酚法測定蛋白質含量,目的要求 掌握Folin酚法測定蛋白濃度的原理和方法實驗原理 蛋白質濃度可以從它們的物理化學性質，如比重、紫外吸收，折射率等測定而得知；或用化學方法，如定氮、雙縮脲反應，Folin酚試劑反應等方法來計算。其中雙縮脲法和Folin酚法是一般實驗室中常用的方法，它們操作簡便，迅速，不需要復雜而昂貴的儀器。Folin酚法靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍。 Folin酚法所用試劑是由兩部分組成，試劑甲相當于雙縮脲試劑，可與蛋白質中的肽鏈起顯色反應。試劑乙中的磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下不穩(wěn)定，易被酚類還原而呈蘭色（鉬蘭和鎢蘭混合物）。,由于蛋白質中含有帶酚基的酷氨酸還原呈蘭色，溶液蘭色的深淺與蛋白濃度有較好的線性關系。因此用Folin酚法測定蛋白質含量，靈敏度較高。 樣品中含酚類化合物及檸檬酸均有干擾作用，如果樣品酸度較高則顯色較淺，要提高碳酸鈉一氫氧化鈉的濃度。此法也可測定溶液中酪氨酸的色氨酸的濃度。 Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一個，只是在各溶液的濃度及填加量上，保溫的溫度及保溫時間上有所不同而已，本實驗所介紹的是本室常用的，靈敏度較高的操作方法。,試劑和器材,1、材料： 本實驗所提取大豆蛋白水提取液，經合適稀釋至可測定范圍。 2、試劑： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸緩沖液。 （2）200g/ml的標準酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin試劑甲：（俗稱堿性銅試劑）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 稱取0.5g酒石酸鉀鈉溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上兩溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一個月。,4、Folin試劑乙：在2升磨口回流裝置的燒瓶內，加鎢酸鈉（NaWO42H2O）100g，鉬酸鈉（NaMoO2M2O）25g，蒸餾水700ml，85%的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分混合后，小火回流10小時，再加硫酸鋰（Li2SO4）150g，蒸餾水50ml及數滴溴。然后開口沸騰15min，以驅除過量的溴，冷卻后定容到1000ml，過濾后呈金黃色，于棕色并中保存，可使用多年。 上述制備的Folin試劑乙的貯備液濃度一般在2mol/L左右，幾種操作方案都是把Folin試劑乙稀釋至1mol/L的酸度作為應用液，我們是把貯備液于作用前稀釋18倍，使之濃度為0.1mol/L略高。這種稀釋18倍后的Folin試劑乙就是下文稱之為應用液，Folin試劑乙貯備液濃度的標定，一般是以酚酞為指示劑，用Folin試劑乙去滴定1mol/L左右的標準NaOH溶液，當溶液顏色由紅變?yōu)樽匣疑?，再突然變成黑綠既為終點。如果用NaOH去滴定Folin乙，終點不太好掌握，溶液的顏色是由淺黃色變?yōu)闇\綠色，再變?yōu)榛易仙珵榻K點。,3、器材：,試管10支 試管架一個 移液管：（5ml、1ml） 移液管架 洗瓶 恒溫水浴 723型分光光度計,操作方法,1、標準曲線的制作： 標準酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸緩沖液溶解的酪蛋白，濃度為200g/ml。用一支0.5ml移液管分別取上述標準酪蛋溶液0ml, 0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml各加到一支試管中去，將此吸管用0.03mol/LPH7.8的磷酸緩沖液，反復洗凈，再用同一支移液管（防止未經標定吸量管的相對誤差的影響）取上述緩沖液將每支試管中的溶液補加至1ml。再在另一支試管中加入1ml緩沖液作空白對照。于上述試管中各加入1mlFolin試劑甲并不時地進行振蕩，10min后再加入后1in試劑乙的應用液4毫升。立既搖勻放入55水溶中保濕5min。取出后用自來水冷卻1min。于波長650nm進行比色測定各管的OD值，以蛋白質的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，既可得到標準曲線。,Folin-酚法測定蛋白質含量工作曲線的制作：取7支試管（干燥的）按下表順序分別加入各種試劑并進行反應和測定,2、樣品測定：取兩支試管（平行）各加入待測的蛋白質樣品液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲線（可取兩支試管編號8、9，與工作曲線同時進行反應和比色測定）；,3.蛋白質濃度的計算： A650值對應的mg數(Pr) Pr(mg/ml)= 稀釋倍數 Pr溶液的ml數,思考題 1、采用Folin的酚法測定樣品的蛋白質含量時，樣品中的什么物質對測定結果有干擾？ 2、作為標準蛋白的酪蛋白在應用時有何要求。,