《發(fā)酵工程》課件

微生物發(fā)酵工程,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,3,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一 發(fā)酵類型： 發(fā)酵類型是為了描述菌體生長，碳源利用與代謝產(chǎn)物形成速率變化，以及它們相互間動力學(xué)關(guān)系而確定的。,5.1微生物發(fā)酵的類型和方式,4,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1動力學(xué)描述參數(shù),菌體生長速率,比生 長速率,菌體得 率系數(shù),產(chǎn)物得率系數(shù),（Vx）：單位體積，單位時間里生長的菌體量 g/(L h),（）： 菌體濃度除菌體生長速率或繁殖速率 h-1,（Yx/s）: 消耗1g或1mol營養(yǎng)物質(zhì)生成的菌體的g數(shù)或mol數(shù),（Yp/s）：消耗1g或1mol營養(yǎng)物質(zhì)生成的產(chǎn)物的g數(shù)或mol數(shù),5,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2發(fā)酵類型,根據(jù)產(chǎn)物的形成與,基質(zhì)消耗的關(guān)系分,6,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2發(fā)酵類型,特點,菌體生長，碳 源利用和產(chǎn)物 形成幾乎都在 相同的時間出 現(xiàn)高峰。,微生物生長和 產(chǎn)物合成是分 開的。 糖既滿 足細(xì)胞生長所 需能量又充作 產(chǎn)物合成的碳 源。,產(chǎn)物形成一般 在菌體生長接 近或達到最高 生長時期。產(chǎn) 物形成與碳源 利用無準(zhǔn)量關(guān) 系。,7,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,8,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1 分批發(fā)酵： 是一種準(zhǔn)封閉式系統(tǒng)。 一次投料，一次接種，一次收獲的間歇式培養(yǎng)方式。培養(yǎng)過程中，接種物要經(jīng)過5個時期。即延遲期、 對數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期和衰亡期。,二 發(fā)酵方式：,分批培養(yǎng)的特點：操作簡單、周期短、染菌機會少和生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握。但是生產(chǎn)率相對較低。,9,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,10,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,減速期,靜止期,衰亡期,特點,11,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,對數(shù)生長期： dX /dt =X 其中： X- 細(xì)胞干重 t- 時間 - 比生長速率 微生物的比生長速率與微生物的種類、培養(yǎng)溫度、pH 、培養(yǎng)基成分及限制性基質(zhì)濃度等因素有關(guān)。,12,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,13,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,分批培養(yǎng)過程的生產(chǎn)率 P: 生產(chǎn)率=產(chǎn)物濃度/發(fā)酵時間 生產(chǎn)率是評價發(fā)酵過程的成本和效率的綜合指標(biāo)。在分批培養(yǎng)時，計算時間還應(yīng)包括放罐、清洗、裝料和消毒的時間等非發(fā)酵過程所占用的時間。,14,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,15,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2. 連續(xù)發(fā)酵：連續(xù)發(fā)酵是指在培養(yǎng)過程中，連續(xù)地向發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，同時以相同的流速從發(fā)酵罐中排出含有產(chǎn)品的培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。一般連續(xù)培養(yǎng)方式很多：攪拌發(fā)酵罐和管式反應(yīng)器；恒化和恒濁；循環(huán)式和非循環(huán)式；單級和多級。,16,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,恒濁,17,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,連續(xù)發(fā)酵,非循環(huán)式：,18,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,單級連續(xù)培養(yǎng)進入穩(wěn)定狀態(tài)后，細(xì)胞的比生長速率與稀釋率相等。 連續(xù)培養(yǎng)的最大特點：微生物細(xì)胞的生長速率、產(chǎn)物 的代謝均處于恒定狀態(tài)，可達 到穩(wěn)定、高速培養(yǎng)微生物細(xì)胞 或生產(chǎn)大量的代謝產(chǎn)物的目 的。生產(chǎn)率得以提高。,19,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,3補料分批發(fā)酵 在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，而不從發(fā)酵罐中間斷地放出培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。 工業(yè)上利用分批補料培養(yǎng)以消除阻遏并保持通氣條件。分批補料培養(yǎng)還可以防止培養(yǎng)基中某一組分的毒性。,20,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,21,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,培養(yǎng)基：提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的，按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。,5.2 培養(yǎng)基選擇和配制的原則,22,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一、培養(yǎng)基的類型和用途,23,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,二.培養(yǎng)基的選擇,24,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,對培養(yǎng)基的要求,提供合成 細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn) 物的基本成分,利于減少培 養(yǎng)基原料的單耗,利于提高培養(yǎng) 及產(chǎn)物的濃度,利于減少能耗,減少副產(chǎn)物， 利于產(chǎn)品的 分離純化,利于提高產(chǎn) 物的合成速率,三培養(yǎng)基的配制原則,25,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,26,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,典型培養(yǎng)基,27,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,完善的培養(yǎng)基設(shè)計是實驗室的實驗，實驗工廠的放大和生產(chǎn)規(guī)模中的一個重要步驟。 培養(yǎng)基的組成必須滿足細(xì)胞的生長和代謝所需的元素，并能提供生物合成和細(xì)胞維持活力所需要的能量。,5.3 培養(yǎng)基的設(shè)計,28,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,1,2,3,4,能源 物質(zhì),碳源 物質(zhì),氮源 物質(zhì),無機鹽和微量 元素,29,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,5,6,7,8,生長 因子,前體,促進 劑和 抑制 劑,水分,30,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,光能：光能自養(yǎng)微生物的能源。極端嗜鹽菌進行海水淡化，藻類發(fā)酵等 氫、硫、氨、亞硝酸鹽、亞鐵鹽等是 化能自養(yǎng)微生物的能源。 碳水化合物等有機物、石油、天然氣及石油化工產(chǎn)品是異養(yǎng)微生物的能源。,1 能源物質(zhì),31,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,。,碳源,細(xì)胞碳骨架,產(chǎn)物,能源,2.碳源物質(zhì),主要包括：糖類，脂類，有機酸，低碳糖等,32,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,脂類,有機 酸類,33,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,有機氮和無機氮,作用,菌體細(xì) 胞結(jié)構(gòu),含氮代 謝產(chǎn)物,細(xì)胞提 供能源,3 氮源物質(zhì),34,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,花生餅粉，黃豆餅粉， 棉籽餅粉，酵母粉， 麥麩，魚粉，蠶蛹粉， 玉米漿，蛋白胨，尿素， 廢菌體和酒糟,氨水， 銨鹽和 硝酸鹽,有機氮,無機氮,35,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,4無機鹽和微量元素,磷，鎂，硫，鐵，鉀，鈉，鉛，氯，鋅，鈷，錳等。較低濃度對細(xì)胞的生長和產(chǎn)物合成有促進作用， 而在高濃度時常表現(xiàn)出顯著的抑制作用,36,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,作用,酶的激活劑,生理活性 物質(zhì)的調(diào)節(jié)劑,生理活性 物質(zhì)的組成,37,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,38,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,硫,含硫氨基酸,許多酶的輔酶的活性基,產(chǎn)物,硫酸鈉,硫代 硫酸鈉,39,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,鐵,鎂,鉀和鈣,40,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,微生物生長不可缺少的微量有機物，稱為生長因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，維生素等。 作用：構(gòu)成細(xì)胞的組成成分，促進生命活動的進行。,5生長因子,41,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1）生物素 作用：影響產(chǎn)生菌細(xì)胞膜的通透性，同時影響菌體的代謝途徑。一般5g/L。,42,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,生 物 素,過量,不足,不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸 產(chǎn)乳酸或琥珀酸 長菌快， pH低，尿素消耗多,菌體生長不好 谷氨酸產(chǎn)量低弱 發(fā)酵向乳酸發(fā)酵轉(zhuǎn)換,43,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2）維生素B1：對某些菌種發(fā)酵有促進作 用。 3）天然原料：玉米漿， 0.4-0.8% 麩皮水解液， 1% 糖蜜， 0.1-0.4% 酵母,44,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,某些化合物被加到培養(yǎng)基后，能夠直接在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而自身的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生太大的變化，卻能提高產(chǎn)品的產(chǎn)量。這類小分子物質(zhì)稱為前體。,6前體,45,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,46,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,7促進劑和抑制劑,促進劑,是一類刺激因子，他們并 不是前體或營養(yǎng)，其加入 可以影響微生物的正常代 謝，或促進中間代謝產(chǎn)物 的積累，或提高次級代謝 產(chǎn)物的產(chǎn)量。,常用的促進劑,誘導(dǎo)物，表面 活性劑，乙二 胺四乙酸， 大 豆油抽提物等。,47,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,在發(fā)酵過程中，加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時刺激另一代謝途徑，以至于可以改變微生物的代謝途徑。,48,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,49,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,8水分,微生物發(fā)酵工程,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,51,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,52,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,1,2,3,4,能源 物質(zhì),碳源 物質(zhì),氮源 物質(zhì),無機鹽和微量 元素,53,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,5,6,7,8,生長 因子,前體,促進 劑和 抑制 劑,水分,54,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,嚴(yán)格控制營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例，不僅僅是為了維持正常的滲透壓，節(jié)約原料，而且直接影響到菌體的繁殖和產(chǎn)物積累。,二營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié),55,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,56,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1).不同碳源的利用速度,能夠被微生物快速利用的碳源稱為速效碳源， 反之為遲效碳源。 利用速度依次為：葡萄糖-乳酸-乳糖,57,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,微生物對氮源的利用速度為：氨態(tài)氮-硝態(tài)氮-有機氮。 氨的過高過低都會對產(chǎn)物形成造成不良的影響。 氮源的利用速度與碳源的利用速度是很有關(guān)系的。 糖代謝的許多中間產(chǎn)物是氨基酸合成的前體。,2).氮源利用和碳源利用的關(guān)系,58,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,生產(chǎn)上多采用控制碳氮比例以滿足菌體 的大量繁殖，又能大量形成產(chǎn)物。 酵母細(xì)胞的碳氮比為：100：20；霉菌 細(xì)胞的碳氮比為：100：10。 發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比約為：100：0.2-2.0。 谷氨酸生產(chǎn)中的碳氮比約為：100：15-21。,3).碳氮比例的調(diào)節(jié),59,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,4).前體的控制,60,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,補料,豐富培養(yǎng)基 產(chǎn)物合成的旺盛期延長,控制pH和代謝方向,改善了通氣效果,解除終產(chǎn)物反饋,5)補料,61,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,補料的物質(zhì),碳，氮和水及其他物質(zhì)。碳源 有葡萄糖，飴糖，蔗糖，糊精 ，淀粉，油脂等。補料氮源有氨 水，硫酸銨，硝酸鈉，蛋白胨， 花生餅粉，黃豆餅粉， 玉米漿 和尿素等。,補料的方法,關(guān)鍵是控制補料時間， 速率和配比。其目的是不 使菌體生長過快，僅僅 維持呼吸，但是仍能合 成產(chǎn)物。,62,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,碳源和能源+氮源+其他需要 細(xì)胞+產(chǎn)物+CO2 + H2O熱量 組成微生物的元素包括、和，這些元素都要在方程中予以平衡。培養(yǎng)基中還需要微量元素(、等)。,三培養(yǎng)基的設(shè)計,63,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,64,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,對于無力合成的生長因子，要通過在培養(yǎng)基中加入適量的純凈物或含有該物質(zhì)的混合物。 碳源具有生物合成的底物和能源的雙重作用。在需氧的條件下對碳源的需要量可以通過菌體得率系數(shù)推算而得,65,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,工業(yè)上，將淀粉水解成葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化。,5.4淀粉水解糖的制備,66,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,發(fā)酵用淀粉水解糖的要求：還原糖含量要高，不含糊精；外觀要潔凈，透明，呈淡黃色；不可變質(zhì)。 制備淀粉水解糖的原料主要有玉米，小麥，大米和薯類等。,67,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,68,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,方法,酸解法,酶解法,酸酶 結(jié)合法,69,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1.淀粉水解糖對發(fā)酵的影響 水解不完全：浪費，逃液，染菌。 水解過度：產(chǎn)生羥甲基糠醛，進而形成類黑素，不僅浪費，而且抑制菌體生長。 淀粉原料中蛋白含量過多，當(dāng)糖液中和，過濾時除去不徹底，會引起發(fā)酵逃液和染菌。,70,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,葡萄糖的理論收率：111%,指 標(biāo),實際 收率,葡萄糖值,淀粉 轉(zhuǎn)化率,2.淀粉制糖過程中考察的指標(biāo),71,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,實際收率=糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）X100% 轉(zhuǎn)化率=糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）X1.11X100% DE值=還原糖（%）/干物質(zhì)含量（%）,72,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,以酸為催化劑，在高溫高壓下，將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。 優(yōu)點：生產(chǎn)簡單，方便，水解時間短，設(shè)備生產(chǎn)能力大。 缺點：要求特殊設(shè)備；易產(chǎn)生副反應(yīng)；對原料要求高 原理： 淀粉 各種糊精 麥芽糖 葡萄糖,二淀粉酸水解法,73,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,影響水解反應(yīng)速率的關(guān)鍵因素：,74,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,淀粉 羥甲基糠醛 乙酰丙酸+蟻酸+有色物質(zhì)等。,其它副反應(yīng),縮短反應(yīng)時間， 控制反應(yīng)， 降低葡萄糖的濃度,減少,75,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,葡萄糖,二糖， 三糖和 其他低 聚糖,酸和熱,復(fù)合反應(yīng),異麥芽糖和龍膽二糖,降低葡萄糖的收率， 發(fā)酵的殘?zhí)窃黾樱?抑制菌體生長和產(chǎn)物形成， 增加提取和精制的難度,76,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,工藝,原料,中和 脫色,過濾 除雜,糖液,調(diào)漿,糖化,冷卻,10.5-12B 0.6-0.7%， pH1.5 左右,糖化時間=達到最大葡萄糖值時的時間-放料時間。,燒堿或純堿中和溫度為60-70， 中和pH4.6-5.0.,活性炭 ，淀粉量的0.6-0.8%。 65C。，pH4.6-5.0。,d =144.3/144.3B,77,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,三雙酶水解法,淀 粉 酶 和 糖 化 酶,優(yōu)點,缺點,條件溫和，無需特殊設(shè)備 無副反應(yīng)，產(chǎn)品純度高，淀粉轉(zhuǎn)化率高。 可在高淀粉濃度下水解,時間長， 設(shè)備多， 過濾難。,78,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,淀粉,a-淀粉酶,葡萄糖， 麥芽糖和 麥芽三糖。 異麥芽糖 和低聚糖。,（一）液化,79,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1.淀粉液化的條件及液化 程度的控制,淀 粉,糊化,老化,受熱后，淀粉顆粒膨脹，晶體結(jié)構(gòu)消失，互相接觸變成糊狀液體，即使停止攪拌，淀粉也不會再沉淀的現(xiàn)象。 60-75。,分子間氫鍵已經(jīng)斷裂的糊化淀粉 又重新排列成新的氫鍵的過程。淀粉酶很難進入老化淀粉的結(jié)晶區(qū)起作用，使淀粉很難液化,淀粉的種類，酸堿度，溫度及加熱方式，淀粉糊的濃度有關(guān)系。,80,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,液化的方法,81,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1）、工藝流程 -,調(diào)漿,高溫 維持,二次 液化,冷卻,糖化,配料,一次噴 射液化,液化 保溫,二次 噴射,2、蒸氣噴射液化工藝及條件,82,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2）、液化的控制,液 化,低,高,液化液的黏度太大，難于操作； 淀粉易老化， 不利于糖化。,糖液的葡萄糖值低，淀粉會老化，影響糖化酶的作用效果。,葡萄糖值為10-20 液化結(jié)束要滅酶 。,83,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,糖化酶的水解作用 糖化是利用糖化酶將淀粉液化產(chǎn)物糊精和低聚糖進一步水解成葡萄糖的過程。 糖化過程葡萄糖含量不斷增加。糖化酶對底物的作用是從非還原性末端開始的。產(chǎn)生a-葡萄糖。糖化酶對a-1,4和a-1,6 糖苷鍵都能水解。,（二）糖化,84,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,液化-糖化-滅酶-過濾-貯糖計量-發(fā)酵,80-100U/g 淀粉 pH 4.2-4.5, 60 數(shù)小時,pH 4.8-5.0 90 30min,60-70 過濾,糖化工藝條件及控制,85,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,86,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,基因工程菌的穩(wěn)定性是高水平發(fā)酵生產(chǎn)的基本條件。,5.5基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策,87,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一、質(zhì)粒不穩(wěn)定性,分裂不穩(wěn)定性,工程菌分裂時出現(xiàn)一定比 例的不含質(zhì)粒的子代菌的 現(xiàn)象,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性,由于DNA從質(zhì)粒上丟失或 堿基重排、缺失所致工程 菌性能的改變,88,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,合適的 宿主,合適的 載體,固定化,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,89,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,基因工程菌的培養(yǎng),補料分批,連續(xù) 培養(yǎng),透析 培養(yǎng),固定化培養(yǎng),延長對數(shù)期 獲得高密度 菌體,難；分段，進行兩階段連續(xù)連續(xù)培養(yǎng)；優(yōu)化誘導(dǎo)水平，稀釋率；細(xì)胞比生長速率,利用膜的半透性使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離,質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高,90,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,高密度培養(yǎng),高密度培養(yǎng)是一個相對概念，一般是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50g/L干重以上，理論上最高值可達200g/L。高密度培養(yǎng)是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝過程 高密度培養(yǎng)可以提高菌體密度，提高單位體積的生產(chǎn)能力，降低生物量的分離費用，縮短生產(chǎn)周期，從而降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。,91,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,影響高密度培養(yǎng)的因素,pH,92,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,影響高密度培養(yǎng)的因素,93,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,如何達到高密度培養(yǎng),