植物組織培養(yǎng)步驟.doc

植物組織培養(yǎng)概念（廣義）又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織.器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。 植物組織培養(yǎng)概念（狹義）指用植物各部分組織，如形成層.薄壁組織.葉肉組織.胚乳等進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。組織培養(yǎng)的步驟一、培養(yǎng)基配制配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購(gòu)買培養(yǎng)基中所有化學(xué)藥品，按照需要自己配制；二是購(gòu)買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如MS、B5等。 自己配制可以節(jié)約費(fèi)用，但浪費(fèi)時(shí)間、人力、且有時(shí)由于藥品的質(zhì)量問題，給實(shí)驗(yàn)帶來麻煩。就目前國(guó)內(nèi)的情況看，大部分還是自己配制。為了方便起見，現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例介紹配置培養(yǎng)基的主要過程。 1、配制幾種母液 （1）配制MS大量元素母液 一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時(shí)再分別稀釋100倍。 分別稱取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般將微量元素配制成100倍母液。 依次稱取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達(dá)到萬分之一，可先配成調(diào)整液。 分別稱取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的調(diào)整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。 （3）配制MS有機(jī)母液 一般配制成100倍MS有機(jī)母液。 依次稱取 肌醇 10g 鹽酸硫胺素（VB1） 0.01g 煙酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 鹽酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 （4）配制MS鐵鹽母液 一般配制成100倍MS鐵鹽母液。 依次稱取 EDTA二鈉 3.73g FeSO4·7H2O 2.78g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機(jī)母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。 激素母液的配制 各種生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制，不能混合在一起，生長(zhǎng)素類一般要先用少量95%的酒精或1當(dāng)量的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。 2、配制培養(yǎng)基 以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進(jìn)行如下操作： （1）先在燒杯中放入一些蒸餾水。 （2）分別取上面八種母液10ml倒入。 （3）一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。 （4）加蒸餾水用量筒定溶至1L。 （5）按設(shè)計(jì)好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對(duì)組培植物的生長(zhǎng)至關(guān)重要。所以有條件的話最好用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。 （6）用精密試紙或酸度計(jì)調(diào)整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計(jì)，比較精確） 可配1當(dāng)量的HCL和1當(dāng)量的NaOH用來調(diào)溶液PH值。 1當(dāng)量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 1當(dāng)量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。 （7）稱取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。 （8）稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。 （9）放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。 （10）滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上令其冷卻凝固。 二、滅菌滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無菌室等未處理的地方、超凈臺(tái)的表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。 這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時(shí)不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。 無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體（當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。 滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種、超凈臺(tái)等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無菌操作。 植物組織培養(yǎng)對(duì)無菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，甚至超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。要達(dá)到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對(duì)象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長(zhǎng)。 常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。 1、培養(yǎng)基用濕熱滅菌 培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。 注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。 關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0.1MPa時(shí)，開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。 按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同，見表。該表所列數(shù)字是徹底滅菌很保險(xiǎn)的數(shù)字，如果容器體積較大，但是放置的數(shù)量很少，也可以減少時(shí)間。 三、接種接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%-3%的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行搽洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行： （1）在接種4小時(shí)前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺菌； （2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈； （3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等； （4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面； （5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干； （6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等； （7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。 接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過程。現(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹。 無菌接種步驟： （1）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或?yàn)V紙上。 （2）材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm平方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。 （3）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程（以試管為例）是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1-3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放（尖端向上）外，其他尚無統(tǒng)一要求。接種完后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒種。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。 四、培養(yǎng)培養(yǎng)指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照、溫度條件、無菌）里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。 1、培養(yǎng)方法 （1）固體培養(yǎng)法 即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡(jiǎn)單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長(zhǎng)速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。 （2）液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r/min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。 2、培養(yǎng)步驟 （1）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長(zhǎng)素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為： 1）頂芽和腋芽的發(fā)育 采用外源的細(xì)胞分裂素，可促進(jìn)使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長(zhǎng)，從而形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型繁殖，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種的一種繁殖方式。 適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。 莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實(shí)際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。 用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長(zhǎng)，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會(huì)生出不定芽，形成芽叢。 2）不定芽的發(fā)育 在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數(shù)情況下它形成芽，后形成根。 另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長(zhǎng)出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營(yíng)養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲(chǔ)藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。 在不定芽培養(yǎng)時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。 3）體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生。 4）初代培養(yǎng)外植體的褐變 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會(huì)抑制其他酶的活性，從而影響所接觸外植體的培養(yǎng)。 褐變的主要原因如下： a、植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對(duì)不同的品種分別進(jìn)行處理。 b、生理狀態(tài)由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般說來，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。 c、培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。 d、培養(yǎng)條件不當(dāng) 如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 為了提高組織培養(yǎng)的成苗率，必須對(duì)外植體的褐變現(xiàn)象加以控制?？梢圆捎靡韵麓胧┓乐?、減輕褐變現(xiàn)象的發(fā)生。 1、選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。 2、合適的培養(yǎng)條件 無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。 3、使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。 4、連續(xù)轉(zhuǎn)移 對(duì)容易褐變的材料可間隔2-24小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-10天后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。 (2)繼代培養(yǎng) 在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不夠，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢(shì)。 繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級(jí)數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng)10代將生成210株苗。 繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長(zhǎng)的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡(jiǎn)便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MS基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小?？上惹谐裳繀残K，放入MS培養(yǎng)基中，待到稍大時(shí)，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。 增殖使用的培養(yǎng)基對(duì)于一種植物來說每次幾乎完全相同，由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競(jìng)爭(zhēng)，所以能夠按幾何級(jí)數(shù)增殖。 在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個(gè)必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)數(shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是儲(chǔ)備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。 （3）繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化 實(shí)踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水跡狀，這種想象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會(huì)使試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。 因?yàn)槌霈F(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。 呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為： a、增加培養(yǎng)基中的 溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)； b、減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量； c、增加光照 d、增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用； e、降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生； f、降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。 3、生根培養(yǎng) 當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去，就會(huì)使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi)。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個(gè)過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)可采用1/2或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入食糧非的生長(zhǎng)素（NAA、IBA等）。 誘導(dǎo)生根可以采用下列方法 a、將新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中處理4-8小時(shí)； b、在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天 c、直接移入含有生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中。 上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前兩種方法對(duì)新生根的生長(zhǎng)發(fā)育則更為有利。而第三種對(duì)幼根的生長(zhǎng)有抑制作用。其原因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長(zhǎng)素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長(zhǎng)發(fā)育。不過這種方法比較可行。 另外也可采用下列方法就可生根。1、延長(zhǎng)在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間；2、有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量（即將增殖與生根合并為一步）；3、切割粗壯的嫩枝在營(yíng)養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長(zhǎng)素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。 另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營(yíng)養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。 從胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長(zhǎng)。但因經(jīng)胚狀體發(fā)育的苗數(shù)特別多，并且個(gè)體較小，所以也常需要一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。 試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了成功地將移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18-20為宜。實(shí)踐證明植物生長(zhǎng)的溫度過高不但會(huì)牽涉到蒸騰加強(qiáng)。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長(zhǎng)遲緩，或不易成活。春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電熱線，使基質(zhì)溫度略高于氣溫2-3，這不但有利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá)，而且有利于提前成活。移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光，（約4000lx左右），以維持光合作用所需光照強(qiáng)度。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，會(huì)使水分平衡的矛盾更尖銳。 五、馴化移栽試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好，就會(huì)造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)該選擇合適的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個(gè)組織培養(yǎng)工作的順利完成。 試管苗由于是在無菌、有營(yíng)養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長(zhǎng)的小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使她們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。 從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環(huán)境生長(zhǎng)，當(dāng)將它們移栽到試管外環(huán)境時(shí)，試管苗失水率會(huì)很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點(diǎn)，則必須經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理，通常采取的措施有：對(duì)外界要增加濕度、減弱光照；對(duì)試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。 另外，對(duì)栽培馴化基質(zhì)要進(jìn)行滅菌是因?yàn)樵嚬苊缭跓o菌的環(huán)境中生長(zhǎng)，對(duì)外界細(xì)菌、真菌的抵御能力極差。為了提高其成活率，在培養(yǎng)基質(zhì)中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑200-500倍液，以進(jìn)行滅菌處理。 1、移栽用基質(zhì)和容器 適合于栽種試管苗的基質(zhì)要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處理，并不利于雜菌滋生的特點(diǎn)，一般可選用珍珠巖、蛭石、砂子等。為了增加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時(shí)需按比例搭配，一般用珍珠巖、蛭石、草炭土或腐殖土比例為1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土為1：1。這些介質(zhì)在使用前應(yīng)高壓滅菌?；蛴弥辽傩r(shí)烘烤來消滅其中的微生物。要根據(jù)不同植物的栽培習(xí)性來進(jìn)行配制，這樣才能獲得滿意的栽培效果。以下介紹幾種常見的試管苗栽培基質(zhì)。 （1）河砂 河砂分為粗砂、細(xì)砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂，其顆粒直徑為1-2mm。細(xì)砂即通常所說的面砂，其顆粒直徑為0.1-0.2nm。河砂的特點(diǎn)是排水性強(qiáng)，但保水蓄肥能力較差，一般不單獨(dú)用來直接栽種試管苗。 （2）草炭土 草炭土是由沉積在沼澤中的植物殘骸經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的腐爛所形成，其保水性好，蓄肥能力強(qiáng)，呈中性或微酸性反應(yīng)，但通常不能單獨(dú)用來栽種試管苗，宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以使用。 （3）腐殖土 腐殖土是由植物落葉經(jīng)腐爛所形成。一種是自然形成，一種是人為造成，人工制造時(shí)可將秋季的落葉收集起來，然后埋入坑中，灌水保濕的條件下使其風(fēng)化，然后過篩即可獲得。腐葉上含有大量的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)物質(zhì)，它通常不能單獨(dú)使用。摻有腐殖土的栽培基質(zhì)有助于植株發(fā)根。 （4）容器 栽培容器可用6*6cm-10*10cm的軟塑料缽，也可用育苗盤。前者占地大，耗用大量基質(zhì)，但幼苗不用移栽，后者需要二次移苗，但省空間、省基質(zhì)。 2、移栽前的準(zhǔn)備 移栽前可將培養(yǎng)物不開口移到自然光照下鍛煉2-3天，讓試管苗接受強(qiáng)光的照射，使其長(zhǎng)得壯實(shí)起來，然后再開口練苗1-2天，經(jīng)受較低濕度的處理，以適應(yīng)將來自然濕度的條件。 3、移栽和幼苗的管理 從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。但要輕輕除去，應(yīng)避免造成傷根。移植時(shí)用一個(gè)筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實(shí)，栽前基質(zhì)要澆透水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環(huán)境中。保證空氣濕度達(dá)90%以上。 （1）保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7天內(nèi)，應(yīng)給予較高的空氣濕度條件，使葉面的水分蒸發(fā)減少，盡量接近培養(yǎng)瓶的條件，讓小苗始終保持挺拔的狀態(tài)。保持小苗水分供需平衡首先營(yíng)養(yǎng)缽的培養(yǎng)基質(zhì)要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭設(shè)小拱棚，以減少水分的餓蒸發(fā)，并且初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)5-7天后，發(fā)現(xiàn)小苗有生長(zhǎng)趨勢(shì)，可逐漸降低濕度，減少噴水次數(shù)，將拱棚兩端打開通風(fēng)，使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。約15天以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，逐漸減少澆水，促進(jìn)小苗長(zhǎng)得粗壯。 （2）防止菌類滋生。由于試管苗原來的環(huán)境是無菌的，移出來以后難以保持完全無菌，因此，應(yīng)盡量不使菌類大量滋生，以利成活。所以應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行高壓滅菌或鴻烤滅菌。可以適當(dāng)使用一定濃度的殺菌劑以便有效的保護(hù)幼苗，如多菌靈、托布津，濃度800-1000倍，噴藥宜7-10天一次。在移苗時(shí)盡量少傷苗，傷口過多，根損傷過多，都是造成死苗的原因。噴水時(shí)可加入0.1%的尿素，或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生長(zhǎng)與成活。 （3）一定的溫、光條件。 試管苗移栽以后要保持一定的溫光條件，適宜的生根溫度是18-20，冬春季地溫較低時(shí)，可用電熱線來加溫。溫度過低會(huì)使幼苗生長(zhǎng)遲緩，或不易成活。溫度過高會(huì)使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡受到破壞，并會(huì)促使菌類滋生。 另外在光照管理的初期可用較弱的光照，如在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報(bào)紙等，以防陽光灼傷小苗和增加水分的蒸發(fā)。當(dāng)小植株有了新的生長(zhǎng)時(shí)，逐漸加強(qiáng)光照，后期可直接利用自然光照。促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，增強(qiáng)抗性，促其成活。 （4）保持基質(zhì)適當(dāng)?shù)耐庑浴?要選擇適當(dāng)?shù)念w粒狀基質(zhì)，保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多，過多的水應(yīng)迅速瀝除，以利根系呼吸。 綜上所述，試管苗在移栽的過程中，只要把水分平衡、適宜的介質(zhì)、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好，試管苗是很容易移栽的。- 11 -