微生物學(xué)檢驗課稿ppt課件

第十章 食品微生物學(xué)檢驗,1,主要內(nèi)容,第一節(jié) 采樣 第二節(jié) 顯微鏡檢驗 第三節(jié) 培養(yǎng)檢查 第四節(jié) 生化試驗 第五節(jié) 血清學(xué)檢驗 第六節(jié) 動物試驗 第七節(jié) 菌落總數(shù)測定 第八節(jié) 大腸菌群測定,2,第一節(jié) 采樣,一、采樣 采樣是從待鑒定的一大批食品中抽取小部分用于檢驗的過程。采樣必須具有代表性。 （一）固體樣品,3,（二）液體樣品 原包裝瓶樣品取整瓶，散裝樣品可用無菌吸管或匙采取。冷凍液體食品，采取原包裝，放入隔熱容器內(nèi)。 （三）罐頭 根據(jù)廠別、商標、品種來源等分類進行采取原包裝樣品。,4,（四）注意事項 采樣時，首先要了解采樣食品的來源、生產(chǎn)時間、批號、加工、貯藏、包裝、運輸?shù)惹闆r； 采樣的器械和容器須滅菌后才可使用。采樣時嚴格進行無菌操作； 不得加防腐劑； 液體食品需攪拌均勻后采取，固體樣品要在不同部位采取，使樣品盡量具有代表性； 取樣后，應(yīng)及時送檢，最多不得超過4h。,5,二、處理,（一）固體樣品 用無菌刀、剪或鑷子稱取不同部位樣品10g，剪碎，放入無菌容器內(nèi)，加定量水，制成1：10混懸液，進行檢驗。 （二）液體樣品 1.原包裝樣品 用點燃的酒精棉秋消毒瓶口，再用消毒過的紗布將瓶口蓋上，開啟后，用無菌吸管直接吸取。,6,2.含二氧化碳的液體樣品 同上方法開啟后，使氣體逸出后進行檢驗。 3.冷凍食品 融化后檢驗。 （三）罐頭 1.密閉試驗 2.膨脹試驗 3.微生物檢驗,7,目的：觀察微生物細胞在生活時期原有的形狀、大小和確定細胞能否運動等。,第二節(jié) 顯微鏡檢驗,一、不染色標本檢驗,在載玻片上滴一滴生理鹽水，再滴加少許要觀察的含菌液體或少量要觀察的固體培養(yǎng)物，使菌體均勻分布，蓋上蓋玻片即可鏡檢。,將待觀察的含菌液體滴在蓋玻片上，然后將其翻身，放置在凹孔載玻片上，使液滴懸掛在凹孔室內(nèi)。在進行不染色標本檢驗時，一般用普通光學(xué)顯微鏡直接觀察。,8,二、染色標本檢查,染色標本能顯示微生物的形態(tài)、排列、一定的構(gòu)造及某些細胞成分的性質(zhì)及其分布的位置，可區(qū)別活菌與死菌，可鑒別微生物的種類等。,三、顯微鏡直接計數(shù)法,比例計數(shù)法：將已知顆粒濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，然后求出未知菌液的細胞濃度。,血球計數(shù)板法：用來測定一定容積中菌 數(shù)的常規(guī)方法。,9,一、培養(yǎng)基的種類,培養(yǎng)基是適合于微生物生長發(fā)育需要的各種營養(yǎng)成分配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)，可供微生物在其中生長繁殖。,第三節(jié) 培養(yǎng)檢查,10,二、微生物接種與培養(yǎng),（一）微生物接種,（二）微生物的培養(yǎng),常用方法：涂布法、劃線法、傾注法、點植法、穿刺法和浸洗法等。,11,三、培養(yǎng)結(jié)果觀察,（一）固體培養(yǎng)基上菌落形狀觀察,大小 形狀 邊緣 表面 隆起度 顏色及透明度,12,（二）液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)形狀的觀察,混濁度 沉淀 表面 培養(yǎng)液的顏色以及是否產(chǎn)氣等,（三）半固體培養(yǎng)基中菌落培養(yǎng)特性的觀察 主要觀察微生物需養(yǎng)與運動情況。,13,四、培養(yǎng)計數(shù)法,（一）液體稀釋法 對未知菌樣作連續(xù)的10倍系列稀釋。選擇在適宜的3個連續(xù)的稀釋液中歌曲5ml試樣，接種到3組共15支裝有培養(yǎng)液的試管中。經(jīng)培養(yǎng)后，記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查MPN表，再根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)即可計算出活菌含量。 （二）平板菌落計數(shù)法 取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在其凝固前混合均勻，或涂布已凝固的固體培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，從平板上（內(nèi)）出現(xiàn)的菌落數(shù)乘上菌液的稀釋倍度，即可計算出原菌液的含菌數(shù)。,14,五、一些新技術(shù)新方法,免疫擴散法 RIA ELISA和免疫傳感器 ELISA雙抗夾心法 PCR技術(shù),15,一、糖類代謝試驗,（一）糖發(fā)酵試驗 不同的微生物可對各種糖類、醇類、糖苷類等進行分解，但其分解能力和分解產(chǎn)物均因不同的微生物而不同。,第四節(jié) 生化試驗,16,常用于糖發(fā)酵試驗的糖類、醇類和糖苷類：,糖類 名稱 戊糖（C5H10O5） 阿拉伯糖（Arabinose） 木糖（xylose） 鼠李糖（rhamnose） 己糖（C6H12O11） 葡萄糖（glucose） 果糖（fructose） 甘露糖（mannose） 半乳糖（galactose） 三糖類（C8H10O5）3） 棉子糖（raffinose） 落葉松糖（melizitose）,17,糖類 名稱 雙糖類（C12H22O11） 麥芽糖（maltose） 乳糖（lactose） 蔗糖（sucrsoe） 海藻（trehalose） 纖維二糖（cellobiose） 蜜二糖（melibiose） 多糖類（C6H10O5）3 ） 菊糖（inulin） 淀粉（starch） 肝糖（glycogen） 糊精（dextrin）,18,糖類 名稱 三元醇（C3H5（OH）3） 甘油（glycerol） 四元醇（C4H6（OH）4） 赤霉糖醇（erythitol） 五元醇（C5H7（OH）5） 核糖醇（adonitol） 六元醇（C6H7（OH）6） 阿拉伯膠醇（Arabitol） 甘露醇（mannitol） 半乳糖醇（dulcitol） 山梨醇（sorbitol） 環(huán)己六醇（CHOH）8） 肌醇（inositol） 糖苷類 水楊苷（salicin） 七葉苷（aescukin） 松柏苷（coniferin）,19,二、蛋白質(zhì)及氨基酸代謝試驗,（二）甲基紅（MOR）試驗 （三）VP（Voges-Proskauer）試驗 （四）半乳糖苷酶試驗,（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗 （二）硫化氫試驗 （三）尿素酶 （四）氨基酸脫氫酶試驗 （五）苯丙氨酸脫氨試驗,20,三、呼吸酶類試驗,（一）硝酸鹽還原試驗 （二）氧化酶（細胞色素氧化酶）試驗 （三）過氧化氫試驗,四、有機酸鹽及銨鹽利用試驗,（一）檸檬酸鹽利用試驗 （二）丙二酸鹽利用試驗,21,五、毒性酶類試驗,（一）軟磷脂酶試驗 （二）血漿凝固酶試驗 （三）鏈激酶試驗,六、其他生化試驗（氰化鉀抗性試驗）,氰化鉀（KCN）是呼吸鏈末端抑制劑，常用于腸桿菌科各屬的鑒別。,22,第五節(jié) 血清學(xué)檢驗,血清學(xué)檢驗是根據(jù)抗原與相應(yīng)抗體在體外發(fā)生特異性結(jié)合，并在一定條件下出現(xiàn)各種抗原抗體反應(yīng)的現(xiàn)象，用于檢驗抗原或抗體的技術(shù)。 血清學(xué)檢驗技術(shù)發(fā)展迅速，主用應(yīng)用于：傳染病診斷、 病原微生物分類鑒定、抗原分析、毒素與抗毒素測定等方面。,23,一、抗原,凡是能刺激有機體產(chǎn)生抗體，并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，稱為抗原（antigen）。這一概念包括兩個基本內(nèi)容，一是刺激有機體產(chǎn)生抗體，通常稱之為抗原性（antigenicity）或免疫原性(immunogenicity)。另一是能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，稱為反應(yīng)原性(reaginicity)。,24,（一）抗原的性質(zhì),異物性,大分子量,特異性,完整性,25,. 完全抗原（complete antigen）:能在機體內(nèi)引起抗體形成，在體外可與抗體發(fā)生特異性 結(jié)合，并在一定條件下出現(xiàn)可見反應(yīng)的物質(zhì)。如細菌、病毒等微生物蛋白質(zhì)和外毒素等。,(二)抗原種類,.不完全抗原（incomplete antigen）或稱半抗原（ hapten）:也稱之為辦抗原（hapten），不能單獨刺激機體產(chǎn)生抗體，需與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合后，可刺激機體產(chǎn)生抗體，但在試管內(nèi)可與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，并在一定條件下出現(xiàn)可見反應(yīng)的物質(zhì)。,26,.細菌抗原,表面抗原,菌體抗原,鞭毛抗原,外毒素和類毒素,菌毛抗原,27,二、抗體,抗體(antibody)是機體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，亦稱免疫球蛋白(immunoglobulin，簡稱Ig)。含有免疫球蛋白的血清，通常被稱為免疫血清或抗血清。,28,抗體的結(jié)構(gòu),29,抗體是一些具有免疫活性的球蛋白 在試管內(nèi)能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合 抗體的分子量都很高,（一）抗體的性質(zhì),30,、根據(jù)其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分,（二）抗體的種類,31,32,33,34,35,.根據(jù)其抗體獲得方式分,3.根據(jù)作用對象不同,4.根據(jù)與抗原接合后的可見反應(yīng)不同,36,三.抗原抗體反應(yīng)（血清學(xué)反應(yīng)）,抗原與抗體無論在體外或體內(nèi)均能發(fā)生特異性結(jié)合，根據(jù)抗原性質(zhì)，反應(yīng)條件及其參與反應(yīng)因素，表現(xiàn)為各種反應(yīng)，統(tǒng)稱為免疫反應(yīng)。若這種反應(yīng)表現(xiàn)在體外則稱之為血清學(xué)反應(yīng)。,37,（一）血清學(xué)反應(yīng)的一般特點 1、特異性和交叉性 2、可逆性 3、結(jié)合比列 4、敏感性 5、階段性 血清學(xué)反應(yīng)特點及用途（表）,38,39,（二）影響血清學(xué)反應(yīng)的條件 1、電解質(zhì) 2、溫度 3、pH值 4、雜質(zhì)異物,40,四、血清學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用,（一）凝集反應(yīng) 1、直接凝集反應(yīng) （1）玻片法：通常為定性試驗，用抗體測未知抗原，如鑒定菌種，測人類紅細胞ABO血型等。 （2）試管法：定量試驗，用抗原測雪青中有無某種抗體及相對含量。 2、間接凝集反應(yīng) 利用某些與免疫無關(guān)的均一小顆粒物質(zhì)作為載體，將可溶性抗原（抗體）吸附于表面，在有電解質(zhì)存在適宜條件下，與相應(yīng)抗體（抗原）結(jié)合，發(fā)生凝集現(xiàn)象。,41,（二）沉淀反應(yīng) 1、環(huán)狀法 常用于抗原定性試驗 2、絮狀法 3、瓊脂擴散法 （1）單向擴散：常做抗體定量試驗。試驗時抗 體預(yù)先在瓊脂中混勻，澆鑄成平板打孔， 抗原注入小孔（圖） （2）雙向擴散：瓊脂澆鑄成平板打孔，抗原、抗 體分別注入小孔。（圖）,42,單向瓊脂擴散,43,雙向瓊脂擴散,44,凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的比較,沉淀反應(yīng),凝集反應(yīng),抗原 體積小總面積大 體積大總面積小大,抗體 需要少 需要多,45,（三）免疫電泳 將瓊脂擴散和電泳技術(shù)結(jié)合的血清學(xué)檢驗方法。 1、對流免疫電泳：雙向擴散與電泳技術(shù)結(jié)合（圖） 2、火箭電泳：單向擴散與電泳技術(shù)結(jié)合（圖） 3、瓊脂免疫電泳：先電泳，后雙向擴散（圖）,46,對流免疫電泳,47,火箭電泳,48,免疫電泳,49,（四）補體結(jié)合反應(yīng),指示系統(tǒng),反應(yīng)系統(tǒng),補體,50,（五）免疫標記技術(shù),1、免疫熒光標記技術(shù) 用熒光素對抗體（或抗原）進行標記，然后用于免疫學(xué)測定。 （1）直接法 抗原 熒光素標記過的抗抗體 抗原結(jié) 合物抗體 （2）間接法 抗原抗體結(jié)合 滴加熒光素標記過的抗抗體 抗原抗體抗抗體復(fù)合物 （3）補體法 抗原抗體補體復(fù)合物 滴加熒光素標記過的抗 補體抗體 抗原抗體補體抗補體抗體復(fù)合物,51,52,2、免疫酶標記技術(shù),用化學(xué)方法將酶與抗原或抗體結(jié)合起來，形成酶標記物，但不影響抗原或抗體的免疫活性及酶的催化活性。 常用辣根過氧化物酶（HRP）、 堿性磷酸酶(AKP)做標記 3、同位素標記技術(shù) 用放射性同位素3H 14C等標記抗原或抗體,53,用于病原微生物的分離與鑒定、病原微生物的致病性測定、微生物毒素的毒力測定一進免疫血清的制備等。 試驗動物：小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、家貓、家禽等 接種方法：灌服、皮膚劃痕、皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射、腦內(nèi)注射。結(jié)扎腸段注射以及滴眼等。,第六節(jié) 動物試驗,54,第七節(jié) 菌落總數(shù)測定,菌落總數(shù)指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性等），得到1g或1ml檢樣中所含細菌菌落的總數(shù)。該培養(yǎng)條件下所得結(jié)果只包括一群在營養(yǎng)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)，主要作為判定食品被污染程度的指標。 具體操作參考國標GB4789.2-94,55,第八節(jié) 大腸菌群測定,大腸菌群指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來自人畜糞便，作為糞便污染指標評價食品衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。 以100ml（g）檢樣大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。 具體操作參考國標GB4789.3-94,56,