共聚焦激光掃描熒光顯微鏡 簡介以及原理ppt課件

共聚焦激光掃描熒光顯微鏡,什么是共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？ 共聚焦激光掃描熒光顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作為光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統(tǒng),共聚焦系統(tǒng) 細胞CT,熒光和熒光顯微鏡,一、熒光的基礎術語 熒光物質： 某些物質在特定波長范圍內的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光長的光線 熒光。受激發(fā)后能產生熒光的物質稱熒光物質或熒光素 激發(fā)光(EXCITATION)： 能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長),發(fā)射光(EMISSION): 發(fā)射光譜；發(fā)射波峰(最大發(fā)射波長) 熒光探針： 能產生熒光的特異性生物染料（PI, Dapi)、標有熒光素的特異性蛋白結合物（熒光抗體） 自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE): 組織或細胞中的某些成份受激發(fā)時可發(fā)出熒光自發(fā)熒光。 漂白(BLEACH)： 熒光物質受激發(fā)時，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失 漂白。,二、熒光顯微鏡術的基本原理,熒光顯微鏡,激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長范圍的激發(fā)光。 帶通濾色鏡(BP)：有寬、窄帶之分。如：BP450-490 長、短通濾色鏡組合（LP + KP）：LP450 + KP490 雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長，透過長波長。 阻斷濾鏡：多為長通濾色鏡；LP490,熒光顯微鏡的不足: 1.無法實現(xiàn)對熒光,透射光的同時采集,無法實現(xiàn)多重熒光的同時采集及共定位。 2.熒光散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。 3.熒光漂白及對細胞組織的照射損傷。 4.無法對樣品進行斷層掃描,完成3D的工作。 5.濾鏡對熒光信號衰減大,靈敏度熒光強度不夠。 6.可以觀查活細胞或組織但細胞或組織內結構高度重疊 7.只能在二維環(huán)境下觀察。 8.樣品不能太厚。 9.熒光的串繞無法回避。 10.放大倍率小。,共聚焦激光掃描熒光顯微鏡基本配置,1.典型產品,Nikon的 Eclipse C1 Plus,Nikon的 Eclipse C1 Plus,1.性能卓越的平場復消色差TIRF物鏡（ 60 x ，100 x）， NA = 1.49.。這是當前數值孔徑最高的油浸物鏡 2.四孔位針孔轉盤：用電腦控制針孔的大小，可在分辨率和光切厚度之間取得最佳平衡。 3.時間間隔可變的Time Lapse: 可以在拍攝過程中不同的時間段采用不同的時間間隔。,2.基本組成,一、基本組成 （一）激光器:多線氬離子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、氦氖綠(543nm)、氦氖紅(633 nm) （二）掃描器(內裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測器) （三）光學裝置：根據樣品中熒光信號的強弱、大小及分布，調節(jié)激光能量、檢測孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測范圍、物鏡和電子放大倍數（zoom），以利于采集各種熒光信號。 （四）計算機圖像存儲與處理及控制系統(tǒng)：實現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實現(xiàn)了全自動程序化控制采集（檢測）樣品熒光圖像的時間和空間，并和同時采集樣品中多重熒光信號的分解及合成圖像，對其進行定量測定。,3.優(yōu)點,一.分辨率（0.1 8m） 二.可重構樣品的三維結構 三.無損傷、連續(xù)光學切片 四.光譜掃描 （分辨由光源波長，物鏡參數和針孔直徑等決定，如60X，NA1.4的物鏡水平分辨率約為0.2 m，垂直分辨率約為0.5m。） （細菌細胞1-2 m，原核生物細胞1-10 m）,優(yōu)點,4.共聚焦原理,利用照明針孔和探測針孔實現(xiàn)點照明和探測，并且被探測點位于焦平面。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點。,共聚焦原理,共聚焦原理,1.點照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大）,共聚焦原理,假設是場照明（非共聚焦），會導致： 一.發(fā)生衍射，使像模糊； 二.散射光干擾（即除了成像點外，其余 點處有散射光進入探測針孔）； 而點照明則不會有這些問題。,共聚焦原理,消除衍射影響,消除背景雜光,共聚焦原理,2.焦平面點成像,共聚焦原理,焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點所成 的像的光像被探測針孔擋住，不會進入光探頭，所以焦平面點成像使像更清晰。,共聚焦原理,所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質量。,5.掃描模式,一. XY軸掃描 二. Z軸掃描,XY軸掃描,（1）單光束掃描模式 其中最常見的掃描安排結合了兩個獨立的掃描鏡，具有中繼光學系統(tǒng)。移動的垂直軸的反射鏡即在試樣上產生XY平面的掃描。但中間需要增加高級別的像差校正光學系統(tǒng)，導致發(fā)光效率降低。,XY軸掃描,（1）單光束掃描模式,XY軸掃描,（2）多光束掃描（尼普可夫圓盤掃描） 多光束掃描技術提供了一個替代的單光束掃描配置照明效率低，而且掃描速度更快。其中旋轉盤掃描儀有數百個孔，其功能作為照明和探測的針孔。由于磁盤掃描顯微鏡形成的實像，可以直接位于CCD照相機的圖像平面中。盡管這方面的優(yōu)勢，它允許實時聚焦和成像的動態(tài)過程，有幾個缺點限制了磁盤掃描共聚焦系統(tǒng)的實際效用。其中最嚴重的是典型的依賴于傳統(tǒng)的廣譜光源，和在磁盤發(fā)生極端的光損失。,XY軸掃描,（2）多光束掃描,XY 軸掃描,奧林巴斯Fluo View300 激光共聚焦掃描系統(tǒng),光電倍增器,雙色鏡,激發(fā)和發(fā)射濾波滑動器,強度調整密度塔,激發(fā)發(fā)射和射柱準直儀,電源,X-Y檢流計鏡掃描控制器,出入口透鏡系統(tǒng),同樣可以實現(xiàn)XZ軸，YZ軸掃描,Z軸掃描,通常的方法是通過計算機控制的馬達以預先設定的步距移動顯微鏡的鏡臺然后采集圖像。 （當然也有通過改變焦平面位置的方法）,光學切片,通過精細平面光切，形成生物樣品不同平面的精細圖象，將一個連續(xù)的光切圖象Z軸重疊就可形成一個完整的三維圖象,光學切片,切片的厚度受物鏡的數值孔徑和針孔直徑影響，比如60X，NA1.4的鏡頭當針孔設定為1mm時，光學切片厚度為0.4微米。,6.整體結構,光電倍增管,掃瞄裝置,空氣冷卻氬激光器,激發(fā)光濾器,共焦針孔,屏障濾光片(,檢流計,物鏡,謝謝！,此課件下載可自行編輯修改，供參考！ 感謝您的支持，我們努力做得更好！,