熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)及熒光染色.ppt

熒光顯微術(shù),1.了解熒光顯微鏡的基本構(gòu)成和基本原理。 2. 初步掌握熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)步驟和使用。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)用品,Olympus熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，擦鏡紙，吖啶橙染料等實(shí)驗(yàn)用材料。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,一、熒光顯微鏡的成像原理 二、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu) 三、熒光顯微鏡的使用方法 四、觀察動植物細(xì)胞的自發(fā)熒光和繼發(fā)性熒光,一、顯微鏡的成像原理,熒光顯微鏡是利用一定波長的光使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生不同顏色的熒光，以用來觀察和分辨樣品中某些化學(xué)成分和細(xì)胞組分的一種顯微鏡。 自發(fā)熒光: 組織、細(xì)胞不經(jīng)熒光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所呈現(xiàn)的熒光，稱為自發(fā)熒光 。 繼發(fā)性熒光: 組織、細(xì)胞經(jīng)熒光色素染色，由于熒光色素和組織細(xì)胞內(nèi)的某種成分結(jié)合后而呈現(xiàn)的熒光為繼發(fā)性熒光 。,二、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和光路圖,1. 基本結(jié)構(gòu): 光源：超高壓汞燈,用以產(chǎn)生強(qiáng)光照(含大量紫外光 ,藍(lán)紫光) 濾片系統(tǒng): 激發(fā)濾色鏡，提供一定波長范圍的激發(fā)光 . 阻斷濾色鏡 ,透過相應(yīng)波長范圍的熒光 ,阻斷 或吸收剩余激發(fā)光 . 二向分色鏡，透射長波光線和反射短波光線的功能 . 熒光物鏡 普通顯微鏡,熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)圖,熒光顯微鏡的光路圖,三 熒光顯微鏡的使用方法,1.汞燈的安裝: 切斷電源 ,從插座上拔下電源線 . 開啟燈室 ,將汞燈安裝到燈架上 . 嚴(yán)防手指觸摸燈管 ,特別是中心球狀部分,以免污染 汞燈裝入燈室 ,封上燈室蓋后 ,方可按通電源 .,（一）熒光顯微鏡的調(diào)整方法,2. 汞燈的點(diǎn)亮: 確信各連接部分皆處于正常狀態(tài) 接通啟動器電源開關(guān) ,按下起動鈕 ,汞燈點(diǎn)亮 ,經(jīng)2-3min ,電弧趨于穩(wěn)定 . 點(diǎn)亮后 15min內(nèi) ,勿切斷電源 ,一旦汞燈熄滅 ,在5min或稍長時間內(nèi) ,不許重新點(diǎn)亮 ,待汞燈冷卻后 ,始能再次點(diǎn)亮 .,3. 汞燈的調(diào)中: 開啟光閥 . 開放孔徑光闌和視場光闌至最大開度 ,即“Min” - “Max” . 旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器 ,無物鏡的空洞進(jìn)入光路, 旋下防塵蓋光線射向鏡臺 . 載物臺上放一白紙 ,讓汞燈電弧像投在其上 . 用燈室外的聚焦桿 ,使電弧像在白紙上聚焦，并用調(diào)中螺釘 ,調(diào)中汞燈。,4.濾色鏡系統(tǒng)的配合使用: 該熒光顯微鏡具激發(fā)濾色鏡 ,阻斷濾色鏡和二向色鏡等。,5. 樣品聚焦: 經(jīng)熒光染料染色的樣品放在載物臺上 ,先用溴鎢燈透射照明 ,用低倍物鏡聚焦 ,待尋找到最佳影像后 ,熄滅溴鎢燈改用汞燈 . 點(diǎn)亮汞燈 ,嵌入系統(tǒng)濾色鏡 使用 UVFL 40X(Oil)和 UVFL 100X(Oil) 油浸物鏡 ,應(yīng)用無熒光浸油 ,物鏡的內(nèi)裝可變光闌應(yīng)適當(dāng)縮小 ,以增大影像反差和清晰度 . 在UVFL 40X(dry)物鏡內(nèi)裝有校正環(huán) ,對較薄或較厚的蓋片進(jìn)行球面校正 .,6.縮小光闌開度 視場光闌(F)和孔徑光闌(A)的開度 ,在觀察樣品時應(yīng)朝“Min”向轉(zhuǎn)動 ,使其適當(dāng)縮小 . 7.光閥的使用 在熒光觀察暫短中止時 ,可用光閥阻斷光路 ,勿 熄滅汞燈 ,以免減短其使用壽命 .,（二）熒光鏡檢樣品的制作,1. 不能使用本身能產(chǎn)生熒光的藥劑 2. 切片標(biāo)本不能太厚 3. 因石蠟可產(chǎn)生青色熒光，采用石蠟制片時，脫蠟必須徹底。切片進(jìn)入水后，應(yīng)充分水洗，再經(jīng)熒光染料處理。 4. 最好采用螢石玻璃制成的載玻片、蓋玻片。 5. 封片時可采用甘油等無熒光的封固劑。,材料: 藻類, 鴨趾草下表皮, 動物結(jié)締組 織, 血細(xì)胞, 花粉. 染液: 0.01%丫啶橙染液. 觀察藻類，鴨趾草下表面葉綠體的自發(fā)熒光 丫啶橙染花粉, 血細(xì)胞, 疏松結(jié)締組織。,四、觀察動植物細(xì)胞的自發(fā)熒光和繼發(fā)性熒光,1.影響熒光顯微鏡成像質(zhì)量的因素 2.激發(fā)濾色鏡和阻斷濾色鏡的功能及區(qū)別？兩者有何關(guān)系？怎樣選用？,思考題,