共聚焦激光掃描熒光顯微鏡 簡介以及原理

.,共聚焦激光掃描熒光顯微鏡,.,什么是共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？共聚焦激光掃描熒光顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM）以激光作為光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術(shù)，對樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng),共聚焦系統(tǒng)細(xì)胞CT,.,熒光和熒光顯微鏡,一、熒光的基礎(chǔ)術(shù)語熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光長的光線熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光(EXCITATION)：能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長),發(fā)射光(EMISSION):發(fā)射光譜；發(fā)射波峰(最大發(fā)射波長)熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI,Dapi)、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE):組織或細(xì)胞中的某些成份受激發(fā)時可發(fā)出熒光自發(fā)熒光。漂白(BLEACH)：熒光物質(zhì)受激發(fā)時，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失漂白。,.,二、熒光顯微鏡術(shù)的基本原理,熒光顯微鏡,激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長范圍的激發(fā)光。帶通濾色鏡(BP)：有寬、窄帶之分。如：BP450-490長、短通濾色鏡組合（LP+KP）：LP450+KP490雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長，透過長波長。阻斷濾鏡：多為長通濾色鏡；LP490,.,熒光顯微鏡的不足:1.無法實(shí)現(xiàn)對熒光,透射光的同時采集,無法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r采集及共定位。2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白及對細(xì)胞組織的照射損傷。4.無法對樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作。5.濾鏡對熒光信號衰減大,靈敏度熒光強(qiáng)度不夠。6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊7.只能在二維環(huán)境下觀察。8.樣品不能太厚。9.熒光的串繞無法回避。10.放大倍率小。,.,共聚焦激光掃描熒光顯微鏡基本配置,.,1.典型產(chǎn)品,Nikon的EclipseC1Plus,.,Nikon的EclipseC1Plus,1.性能卓越的平場復(fù)消色差TIRF物鏡（60 x，100 x），NA=1.49.。這是當(dāng)前數(shù)值孔徑最高的油浸物鏡2.四孔位針孔轉(zhuǎn)盤：用電腦控制針孔的大小，可在分辨率和光切厚度之間取得最佳平衡。3.時間間隔可變的TimeLapse:可以在拍攝過程中不同的時間段采用不同的時間間隔。,.,2.基本組成,一、基本組成（一）激光器:多線氬離子(458nm,488nm,514nm)、氦氖綠(543nm)、氦氖紅(633nm)（二）掃描器(內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測器)（三）光學(xué)裝置：根據(jù)樣品中熒光信號的強(qiáng)弱、大小及分布，調(diào)節(jié)激光能量、檢測孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom），以利于采集各種熒光信號。（四）計算機(jī)圖像存儲與處理及控制系統(tǒng)：實(shí)現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實(shí)現(xiàn)了全自動程序化控制采集（檢測）樣品熒光圖像的時間和空間，并和同時采集樣品中多重?zé)晒庑盘柕姆纸饧昂铣蓤D像，對其進(jìn)行定量測定。,.,3.優(yōu)點(diǎn),一.分辨率（0.18m）二.可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)三.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片四.光譜掃描（分辨由光源波長，物鏡參數(shù)和針孔直徑等決定，如60X，NA1.4的物鏡水平分辨率約為0.2m，垂直分辨率約為0.5m。）（細(xì)菌細(xì)胞1-2m，原核生物細(xì)胞1-10m）,.,優(yōu)點(diǎn),.,4.共聚焦原理,利用照明針孔和探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和探測，并且被探測點(diǎn)位于焦平面。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)。,.,共聚焦原理,.,共聚焦原理,1.點(diǎn)照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大）,.,共聚焦原理,假設(shè)是場照明（非共聚焦），會導(dǎo)致：一.發(fā)生衍射，使像模糊；二.散射光干擾（即除了成像點(diǎn)外，其余點(diǎn)處有散射光進(jìn)入探測針孔）；而點(diǎn)照明則不會有這些問題。,.,共聚焦原理,消除衍射影響,消除背景雜光,.,共聚焦原理,2.焦平面點(diǎn)成像,.,共聚焦原理,焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點(diǎn)所成的像的光像被探測針孔擋住，不會進(jìn)入光探頭，所以焦平面點(diǎn)成像使像更清晰。,.,共聚焦原理,所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質(zhì)量。,.,5.掃描模式,一.XY軸掃描二.Z軸掃描,.,XY軸掃描,（1）單光束掃描模式其中最常見的掃描安排結(jié)合了兩個獨(dú)立的掃描鏡，具有中繼光學(xué)系統(tǒng)。移動的垂直軸的反射鏡即在試樣上產(chǎn)生XY平面的掃描。但中間需要增加高級別的像差校正光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)光效率降低。,.,XY軸掃描,（1）單光束掃描模式,.,XY軸掃描,（2）多光束掃描（尼普可夫圓盤掃描）多光束掃描技術(shù)提供了一個替代的單光束掃描配置照明效率低，而且掃描速度更快。其中旋轉(zhuǎn)盤掃描儀有數(shù)百個孔，其功能作為照明和探測的針孔。由于磁盤掃描顯微鏡形成的實(shí)像，可以直接位于CCD照相機(jī)的圖像平面中。盡管這方面的優(yōu)勢，它允許實(shí)時聚焦和成像的動態(tài)過程，有幾個缺點(diǎn)限制了磁盤掃描共聚焦系統(tǒng)的實(shí)際效用。其中最嚴(yán)重的是典型的依賴于傳統(tǒng)的廣譜光源，和在磁盤發(fā)生極端的光損失。,.,XY軸掃描,（2）多光束掃描,.,XY軸掃描,奧林巴斯FluoView300激光共聚焦掃描系統(tǒng),光電倍增器,雙色鏡,激發(fā)和發(fā)射濾波滑動器,強(qiáng)度調(diào)整密度塔,激發(fā)發(fā)射和射柱準(zhǔn)直儀,電源,X-Y檢流計鏡掃描控制器,出入口透鏡系統(tǒng),.,同樣可以實(shí)現(xiàn)XZ軸，YZ軸掃描,.,Z軸掃描,通常的方法是通過計算機(jī)控制的馬達(dá)以預(yù)先設(shè)定的步距移動顯微鏡的鏡臺然后采集圖像。（當(dāng)然也有通過改變焦平面位置的方法）,.,光學(xué)切片,通過精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平面的精細(xì)圖象，將一個連續(xù)的光切圖象Z軸重疊就可形成一個完整的三維圖象,.,光學(xué)切片,切片的厚度受物鏡的數(shù)值孔徑和針孔直徑影響，比如60X，NA1.4的鏡頭當(dāng)針孔設(shè)定為1mm時，光學(xué)切片厚度為0.4微米。,.,6.整體結(jié)構(gòu),光電倍增管,掃瞄裝置,空氣冷卻氬激光器,激發(fā)光濾器,共焦針孔,屏障濾光片(,檢流計,物鏡,.,謝謝！,