石蒜生物堿成分研究進展分析研究 生物技術(shù)專業(yè)

石蒜生物堿成分研究進展摘 要石蒜（Lycoris radiata.）是石蒜科石蒜屬(Lycoris Herb.)植物, 是單子葉植物綱，石蒜科(Amaryllidaceae),是一類具地下鱗莖的多年生草本植物,因為其喜生于溪谷石縫處,并且鱗莖形似蒜頭 ,故中文名稱之為石蒜, 別名有蒜頭草、老鴉蒜。石蒜屬是單子葉植物綱石蒜科中的一個重要的屬，為多年草本植物，野生或載培，是東亞特有屬，是一類具有藥用價值和經(jīng)濟價值的藥用植物。石蒜不僅是優(yōu)良的園藝植物，也是傳統(tǒng)的藥用植物。石蒜鱗莖有毒性，味辛，性平，有解毒、祛痰、利尿、催吐之功效，主要應(yīng)用于治療咽喉腫痛、癰腫瘡毒、水腫、小便不利、咳嗽痰喘、食物中毒等癥 。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,石蒜在延緩衰老等領(lǐng)域具有顯著作用。蒜屬植物不僅具有極其高的觀賞價值,并且也是一類非常重要的藥用植物,具有很高的經(jīng)濟價值，其蒜屬植物的鱗莖中含多糖、生物堿、黃酮類、凝集素等多種化學(xué)成分。從其化學(xué)成分的種類及其提取分離方法、檢測方法等方面,對石蒜屬植物近年來研究的主要進展及一些重要的結(jié)果進行了總結(jié)歸納,指出今后應(yīng)該加強石蒜屬植物藥用成分的積累與環(huán)境、生長發(fā)育、栽培技術(shù)的關(guān)系及綜合利用研究。關(guān)鍵詞：石蒜屬；石蒜科生物堿；生物堿；藥理學(xué)作用AbstractThe genus Lycoris (Amaryllidaceae) is mainly distributed in the temperate wood lands of eastern Asia, particularly in China and Japan. Lycoris contains various types of alkaloids with a wide range of biological activities. Amaryllidaceae alkaloids affect the central nervous system and have acetylcholinesterase-inhibitory, analgesic, anti-inflammatory, antiviral, antimalarial, antitumor, or antineoplastic activity. Lycoris radiata, a perennial monocot, is endemic in China, Japan and Korea. It is commonly known as Shi Shuan and used in China as a traditional folk medicine, from which more than ten indole alkaloids have been isolated. The previous phytochemical studies revealed that L. radiata contained crinine, galanthamine, lycorine, homolycorine and montanine type alkaloids. Amaryllidaceae alkaloids with diverse structural architectures are all biogenetically derived fromnorbelladine or its derivatives, which are produced in plants from aromatic aldehydes and tyramine This review is an extensive coverage of all naturally occurring alkaloids from Lycoris along with their various bioactivities. The distribution, chemotaxonomy significance, synthesis, and biological activity of alkaloids are summarized. In the cases where sufficient information is available, the structure_activity relationship (SAR) and the mode of action of the active alkaloids have been presented. Key words: Lycoris；Amaryllidaceae；alkaloids; Pharmacological activity目 錄1 引言32 石蒜生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)22.1石蒜屬植物生物堿的種類32.2石蒜堿型生物堿102.3加蘭他敏型生物堿32.4文殊蘭型或網(wǎng)球花胺型生物堿.33石蒜的提取33.1傳統(tǒng)提取法33.3微波萃取法34石蒜堿的分離和純化34.1傳統(tǒng)純化的方法34.2色譜法34.3樹脂吸附法35石蒜屬植物的藥用價值35.1石蒜屬植物的藥理作用35.1.1抑制乙酰膽堿酯酶作用35.1.2抗腫瘤活性35.1.3對多發(fā)性骨髓瘤的抑制35.1.4對人白血病的抑制35.1.5對乳腺癌的抑制35.1.6抗病毒、抗菌作用機制的研究35.1.7抗寄生蟲、抗瘧疾作用35.1.8抗炎活性35.1.9心血管系統(tǒng)35.2.0其他作用36生態(tài)效益和人工繁殖36.1生態(tài)效益36.2人工繁殖36.3展望37小結(jié)3致謝31 引言石蒜屬(Lycoris Herb .)是單子葉植物綱，石蒜科(Amaryllidaceae),是一類具地下鱗莖的多年生草本植物,因為其喜生于溪谷石縫處,并且鱗莖形似蒜頭 ,故中文名稱之為石蒜, 別名有蒜頭草、老鴉蒜;有些地方因該屬很多種花被的裂片強烈反卷 ,故又稱之為龍爪花;還有一些地方因其鱗莖有毒性, 可作為土農(nóng)藥殺滅害蟲,故稱為蟑螂花.石蒜屬植物的英文名有 Magic Lily 、Surprise 、Lily(Adams ,1976)、Spider Lily。石蒜屬是單子葉植物綱石蒜科中的一個重要的屬，為多年草本植物，野生或載培，是東亞特有屬，是一類具有藥用價值和經(jīng)濟價值的藥用植物，據(jù)不完全統(tǒng)計，該屬全世界約20種，均為美麗花卉，主要分布于東亞的暖溫帶至亞熱帶，從中國西南到日本和朝鮮南部，少數(shù)產(chǎn)印度支那北部和尼泊爾延伸。分布我國種類最多，有15種2變種，其中12種為特有種。日本6種、朝鮮2種、老撾1種、緬甸1種。日本東亞分布。該屬植物作為球根花卉，其品種眾多，有花紅的、粉紅花的、黃花的、淡紅紫色的、百合型的、白長筒型的等，葉期似蘭花，花期像金燈，具有良好的觀賞價值，和藝術(shù)價值，及藥用價值?？捎糜谇谢?、盆花和地被植物造景；屬名(Lycoris )拉丁文含義是希臘神話中女海神的名字,象征該屬植物的艷麗花色。此外，有些品種特有的石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏等，都是臨床醫(yī)療的重要藥物。因此，石蒜屬植物不僅是一類具有開發(fā)潛力的花卉資源，并且石蒜屬植物也是具有發(fā)展前途的藥用植物資源。石蒜屬植物很早就被用作藥用價值來治病療傷，在本草綱目中有記載：石蒜有解毒、祛痰、利尿、催吐等多種功效，還可以用于咽喉腫痛、癰腫瘡毒、瘰疬、水腫等1。目前國內(nèi)外學(xué)者對該屬植物的核型的研究已經(jīng)是相當(dāng)深入 ,但至今仍未能解決石蒜屬種間關(guān)系和起源中心等伊系列有關(guān)的一些有爭議的問題.迄今為止, 對于石蒜屬的解剖學(xué)、生殖生物學(xué)、分子系統(tǒng)和進化等方面的知識我們所了解的仍然十分有限。石蒜屬植物的形態(tài)為:地下鱗莖近球形或卵形,鱗莖皮褐色,葉帶狀; 花莖實心,花葶高30-60厘米,一般由4-7朵組成頂生傘形花序。花被漏斗狀,花柱長于雄蕊,花后蒴果;（3）2石蒜屬植物生物堿的種類2.1我國是從20世紀(jì)50年代開始石蒜的研究。從紅花石（L. radiata  Herb）、黃花石蒜（L. Aaurea  Herb.）分別分離到7種已知生物堿：lycoris,homelycoris，tazettine，galanthmine，lycorenine，和pseudolycorine，從紫花石蒜（L.  squamigera  Maxim.）中分得19種結(jié)晶生物堿，其中12種生物堿分為證明為：lycorine，homolycorine，tazettine,galanthamine,lycoramine，lyccrenine，pseudoly2corine，epigalanthamine，vittatine，pluviine和hippeastrine.其結(jié)構(gòu)如下 (1)高石蒜堿(homolycorine) (2)石蒜倫堿（lycorine) (3）去甲普魯維因（norpluviine) (4)加蘭他敏（galanthamine) （5）表加蘭他敏（epigalanthamine) (6)維他廷（vittatine） （7）普魯維因（pluviine) (8)力克拉敏（lycoramine） (9）小星蒜堿(hippeastrine) (10)石蒜堿（lycorine) (11)偽石蒜堿（pseudoly2corine) （12）漳州水仙堿（tazettine) 2.2石蒜堿型生物堿從石蒜屬植物分離后得到 17 個石蒜堿型的生物堿。從紫花石蒜、紅花石蒜、長筒石蒜、廣西石蒜、香石蒜，中分離得到石蒜堿（lycorine，1）從紅花石蒜6中分離得到 5,6-dehydrolycorine（2）dihydrolycorine（3）、7-oxodihydrolycorine（4）3 從香石蒜、紅花石蒜中分離得到了 ungminorine、（5）；從香石蒜中分離得到了 ungminorine N-oxide（6）；從紅花石蒜中分離得到 lycoranineA（7）、lycoranine B （ 8 ）；從長筒石蒜中分離得到 ()-amarbellisine（9）；從橙黃石蒜中分離得到 LT1（10）；從紅花石蒜中分離得到了孤挺花寧堿（caranine， 11）；從紅花石蒜16中分離得到 hippadine（12）；從紅花石蒜、香石蒜中分離得到了雪花堿（galanthine, 13）；從紅花石蒜、紫花石蒜、廣西石蒜中分離得到了 pseudolycorine（14）；從紫花石蒜、紅花石蒜中分離得到 norpluviine（15）；從紫花石蒜、黃花石蒜中分離得到 pluviine（16）；從香石蒜中分離得到 incartine（17） (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17)石蒜屬植物中石蒜堿型生物堿Lycorine type alkaloids from plants of Lycoris Herb.2.3加蘭他敏型生物堿 從石蒜屬植物中分離得到 14 個加蘭他敏型生物堿。從廣西石蒜中分離得到那維定（narwedine，18）；從廣西石蒜、紫花石蒜、黃花石蒜中分離得到 norgalanthamine（ 19 ）；從紅花石蒜中分離得到 N-demethyllycoramine（20）；從 廣 西 石 蒜中 分 離 得 到 N- allylnorgalanthamine（21）；從黃花石蒜、香石蒜、紫花石蒜、黃花石蒜中分離 得 到 了 O- 去 甲 石 蒜 胺 （ O- demethyllycoramine，22）；從香石蒜、紅石蒜、紫花石蒜、黃花石蒜、紅花石蒜中分離得到sanguinin（23）；從紅花石蒜、香石蒜中分離得到了 N-氧化加蘭他敏（galanthamine N-oxide，24）；從紅石蒜中分離得到 sanguinine N-oxide（25）；從紅石蒜中分離得到 norsanguinine（26）；從紅花石蒜、長筒石、廣西石蒜、香石蒜、黃花石蒜、紫花石蒜中分離得到加蘭他敏（galanthamine27）；從紅花石蒜、長筒石蒜、紫花石蒜、紅石蒜、廣西石蒜、香石蒜、紅石蒜、黃花石蒜、乳白石蒜、紫花石蒜中分離得到了石蒜胺（lycoramine，28）；從紅花石蒜、乳白石蒜、紅石蒜中分離得到了 N-氧化石蒜胺（lycoramine N-oxide，29）從紫花石蒜中分離得到表加蘭他敏（epi-galanthamine，30）；從紅石蒜中分離得到、norbutsanguininem（31）。 (18) （19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31)石蒜屬植物中加蘭他敏型生物堿Galanthamine type alkaloids from plants of Lycoris Herb.2.4文殊蘭型或網(wǎng)球花胺型生物堿從石蒜屬植物中分離得到 10 個文殊蘭型或網(wǎng)球花胺型生物堿。從紅花石蒜、乳白石蒜、紫花石蒜、紅石蒜中分離得到了網(wǎng)球花胺（haemanthamin，32）；從紅花石蒜中分離得到了 O-去甲球花胺（O-demethylhaemanthamine，33）；從紅花石蒜、紫花石蒜、紅石蒜、白花石蒜中分離得到了網(wǎng)球花定堿（haemanthidine，34）；從長筒石蒜19中 分 離 得 到 了 6- 羥 基 文 殊 蘭 胺 （ 6- hydroxycrinamine，35）3；從紅花石蒜、長筒石蒜中分離得到了6-羥基文殊蘭胺（6-hydroxycrinamine，36）；從紅花石蒜、紫花石蒜、長 筒 石 蒜中 分 離 得 到 了 11- 羥 基 條 紋 堿（11-hydroxyvittatine，37）；從紫花石蒜、紅花石蒜中分離得到了條紋堿（vittatine，38）；從廣西石蒜、長筒石蒜中分離得到文殊蘭堿（crinine，39）；從紅花石蒜中分離得到了 6-乙?；氖馓m胺（6-acetoxycrinamine，40）；從長筒石蒜中分離得到了 macowine（41）。 (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41)石蒜屬植物中文殊蘭型或網(wǎng)球花胺型生物堿Crinine and haemanthidine type alkaloids from plants of Lycoris Herb.3石蒜的提取3.1傳統(tǒng)提取法 石蒜堿在一開始是在1895年由森島從石蒜的鱗莖中分離得到。石蒜堿一般都是采用溶劑提取的方法進行提取。低級醇類、酸水、抽取液常常用來提取石蒜堿，這些溶劑濃縮以后就可以得到含有石蒜堿的浸膏，在不同的PH值條件下進行分離得到石蒜堿，因為利用的抽取液濃縮后得到的鹽溶于水并且與浸膏中其它各種生物堿之間的堿性的差異就可以得到石蒜堿。李霞考察了乙醇的質(zhì)量分散，及提取溫度和固液比、以及提取時間對石蒜中的加蘭他敏和石蒜堿得率的影響，就是運用一步法提取石蒜中的加蘭他敏和石蒜堿4。其研究結(jié)果表明了，最佳的工藝條件是：在75%乙醇下提取溫度為65攝氏度時對石蒜堿進行4小時的提取并且固液比為1比6的條件下，加蘭他敏的得率為為0.04793%，提取率為98.90%。石蒜堿的得率為0.03643%，提取率為99.35%。這一研究結(jié)果為石蒜類產(chǎn)品的深度開發(fā)利用以及資源綜合利用提供了重要的依據(jù)，和強有力的說服力使得石蒜堿得到更加充分的利用。3.2酶法 我們把石蒜鱗莖作為研究的原料，并且采用了復(fù)合酶預(yù)處理的方法，將稀鹽酸浸潤提取，并且采用超聲波輔助提取的方法，和氯仿萃取方法的提取石蒜堿5。為了縮短提取時間，并且較大地提高石蒜堿的得到率，一種方法是將超聲波提取法以及復(fù)合酶解法有效地結(jié)合在一起。此種方法的反應(yīng)條件非常溫和，所需要得設(shè)備簡單易得，所需的實驗流程簡單明了，這種實驗方法的設(shè)計合理可行。還有一種方法是將黃花石蒜的鮮球莖清洗干凈后切成片，加入水以后用纖維素復(fù)合酶對黃花石蒜的鮮球莖的片進行酶解處理，其目的是將黃花石蒜的細(xì)胞壁分解，將黃花石蒜調(diào)節(jié)為偏堿性的，經(jīng)過離心、過濾、萃取、濃縮、反萃取、調(diào)堿、過濾、重結(jié)晶，得到石蒜堿，此種方法得到的石蒜堿成的純度可以達到99%之高。這種方法就是用纖維素酶酶解法將石蒜植物塊莖中提取得到的石蒜堿的工藝流程和工藝條件，此種工藝的優(yōu)點在于，操作簡單，非常的節(jié)省時間，可以作為連續(xù)生產(chǎn)，應(yīng)用到生產(chǎn)上.3.3萃取法（微波）首次利用微博輔助提?。∕AE)技術(shù)的是Canzler，Canzler的提取方法為：1、將石蒜物料放置在于微波爐中進行微波輻射，然后可以用水、酸水或有機溶劑進行提取和過濾，提取和過濾后便可以得到含有石蒜生物堿的提取液6。2、然后可以采用微波輻射溶劑，回流提取的方法，提取石蒜中的石蒜堿，如果石蒜樣品在溶劑提取后進行微波輻射，石蒜堿的提取率并不高，但如果在溶劑提取前進行微波輻射，石蒜堿的提取率明顯增高，那是因為微波的輻射作用將石蒜堿的細(xì)胞壁破壞了，使得石蒜生物堿更加容易被溶劑提取出來，微波輻射大大強化了提取的過程； 3、由于這種方法提高了提取效率，是以離子液體溶液為溶劑，所以適用于工業(yè)生產(chǎn)，成批量化的生產(chǎn)。更重要的是此種實驗方法不僅設(shè)備簡單，操作簡單，無污染，更加適合成批量的大型生產(chǎn)。例如可以利用到提取羽扁豆、玉米等植物中的油脂、棉籽酚等成分。由于此種方法快速、高效、溶劑用量少、污染小，在天然產(chǎn)物提取的實驗中應(yīng)用越來越普遍和廣泛，更多的是應(yīng)用在藥物成分的提取上。4石蒜植物的分離和純化4.1傳統(tǒng)純化的方法石蒜堿的傳統(tǒng)提取純化一般采用的非常少，那是因為此種技術(shù)需要消耗大量的有機溶劑，在萃取的時候有容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，操作起來需要大量的時間，產(chǎn)生乳化現(xiàn)象后又容易影響分離提取的效果。具體的操作步驟為：首先采用低碳醇類的溶劑進行抽取，經(jīng)過減壓濃縮后得到含有石蒜堿的石蒜浸膏；在得到石蒜浸膏后經(jīng)酸、堿處理后，利用親脂性的生物堿易溶于親脂性生物堿的有機溶劑，并且次溶劑鹽溶于水的性質(zhì)，以及總生物堿中各種單體生物堿之間堿性的差異，在不同的pH值條件下進行分離純化7。得到最終的產(chǎn)物。4.2色譜法色譜法（chromatography）又稱色譜分析、色譜分析法、層析法，是一種分離和分析方法，在分析化學(xué)、有機化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。此種方法具有提取物的純度高、操作簡單、節(jié)省原料及時間，所以工業(yè)上一般采用萃取法。此方法利用混合物組分在固定相中吸附和分配系數(shù)的微小差別，達到各組彼此分離的目的8。采用STREAMLINE SP陽離子交換樹脂吸附、緩沖溶液洗脫、薄層層析跟蹤檢測洗脫流分，然后采用萃取和蒸餾濃縮含有大量石蒜堿進行色譜分析，得石蒜堿游離的石蒜堿的粗品，再用甲醇有機溶劑進行結(jié)晶，便能得到純度為99%左右的石蒜堿的游離結(jié)晶9。4.3樹脂吸附法 樹脂吸附法是一種分離有效成分的途徑。大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的一類有機高聚物吸附劑，它具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的吸附性能。用大孔吸附樹脂純化石蒜堿，首先將大孔吸附樹脂用乙醇浸泡后濕法裝柱，用乙醇流動相清洗至流出與水按1比5混合不呈白色混濁，再以大量水沖洗至水洗液沒有乙醇味為止。在將不同濃度下提取的不同石蒜堿的粗提取物的水溶液以不同的水流速度進行沖洗，吸附飽和以后用蒸餾水洗到流出液在在292NM處便無吸收。再用解吸劑溶液洗脫，分段收集洗脫液并測定石蒜堿含量10。用該樹脂純化一次產(chǎn)品經(jīng)HPLC方法檢測石蒜堿含量提高了兩倍多，且因提取和洗脫使用食用級乙醇，屬于環(huán)境友好的提取純化工藝。5石蒜植物的藥用價值石蒜屬植物不僅是優(yōu)良的園藝植物，也是傳統(tǒng)的藥用植物。莖有毒性，味辛，性平，有解毒、祛痰、利尿、催吐之功效，主要應(yīng)用于治療咽喉腫痛、癰腫瘡毒、水腫、小便不利、咳嗽痰喘、食物中毒等癥 。5.1石蒜屬植物的藥理作用5.1.1抑制乙酰膽堿酯酶作用乙酰膽堿是腦神經(jīng)元中傳遞信息的一種神經(jīng)遞質(zhì)，腦細(xì)胞有了這種神經(jīng)遞質(zhì)，感覺和記憶力才得以形成。而乙酰膽堿酯酶是神經(jīng)系統(tǒng)中水解乙酰膽堿的一種主要酶類，其基本功能為催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿11?，F(xiàn)代研究表明，老年癡呆癥患者腦內(nèi)乙酰膽堿大量減少，因此，抑制乙酰膽堿酯酶的活性是治療本病的一條要途徑。采用生物自顯影的方法測定石蒜堿對乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石蒜堿對AChE具有較弱的抑制作用(IC50=450 M)，通過和具有相同活性的石蒜堿類似物進行結(jié)構(gòu)比較，推測石蒜堿及其衍生物的AChE抑制活性與分子中的兩個游離羥基有關(guān)。Elgorashi E E等也進行了類似的研究，他們研究了23種石蒜科生物堿的AChE抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石蒜堿的1位被乙酰氧基取代后對AChE有顯著的抑制活性(IC50=096 M)，其抑制作用是加蘭他敏的兩倍以上，而1、2位都用乙酰氧基取代后，活性降低(IC50=211 M)12。由此可見，分子中的1位和2位的取代基團對活性的影響很大。也有學(xué)者認(rèn)為石蒜堿的c環(huán)芳香化以后對AChE的抑制活性增強。Lee S S等在石蒜堿的基礎(chǔ)上合成了一些衍生物，通過測定這些衍生物的AChE抑制活性，并通過AutoDock 305 等分子對接軟件研究石蒜堿及其衍生物與AChE間的作用，總結(jié)了石蒜堿及其衍生物對AChE抑制作用的構(gòu)效關(guān)系：石蒜堿分子中D環(huán)的開環(huán)可以提高其AchE抑制活性，而且使溶解性變大；分子中氮原子上的取代基對活性有顯著影響，氮原子上甲基或丁基取代后活性較強，比乙基、丙基等取代的活性強。以上研究提示我們，通過對石蒜堿及其衍生物構(gòu)效關(guān)系的深入研究，有望發(fā)現(xiàn)比現(xiàn)有藥物作用更強的乙酰膽堿酯酶抑制藥物13。  5.1.2抗腫瘤活性      體外實驗表明，石蒜堿對人乳腺癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人離體鼻咽癌細(xì)胞 等有明顯的抑制作用 ，其作用機制可能是抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成石蒜堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機制比較復(fù)雜，對不同的腫瘤細(xì)胞，其機制還有一些差別，通過對其構(gòu)效關(guān)系的研究，推測A、B、C三個環(huán)可能是其抗癌活性的必須結(jié)構(gòu)。  5.1.3對多發(fā)性骨髓瘤的抑制性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白的漿細(xì)胞惡性增生性血液腫瘤，占血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的10，是一種難治性血液系統(tǒng)疾病，易對標(biāo)準(zhǔn)化療劑量耐藥，隨著世界人口的老齡化，發(fā)病率有上升趨勢，危害性日趨嚴(yán)重。我們擬以人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系KM3為研究對象，觀察石蒜堿治療多發(fā)骨髓瘤的體外效應(yīng)和探討其作用機制，期望為MM的治療及抗腫瘤藥物作用靶點提供新的思路。通過MTT比色，繪制生長曲線觀察石蒜堿的抑瘤效應(yīng)；顯微鏡直接觀察，乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測反映細(xì)胞膜完整性14；DNA凝膠電泳分析，熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)研究石蒜堿誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期時相變化和細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用細(xì)胞免疫組化SABC技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞色素c從線粒體中的釋放；進行caspase-3、8、9比活性分析caspase的活化15；運用Western Blot檢測Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl一2和促凋亡蛋白Bax以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CyclinDl及Cdk4在石蒜堿作用前后的表達改變。  實驗結(jié)果提示石蒜堿具有體外抑制KM3細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)KM3細(xì)胞凋亡作用，可能是一個潛在的治療多發(fā)性骨髓瘤新藥。石蒜堿通過激活線粒體通路和膜死亡受體通路誘導(dǎo)KM3細(xì)胞凋亡，BaxBcl一2是石蒜堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要作用靶點，并通過下調(diào)CyclinDlCdk4阻止腫瘤細(xì)胞增殖16。  5.1.4對人白血病的抑制     石蒜堿在體內(nèi)外可明顯抑制人早幼粒細(xì)胞白血病HD60細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡化療是白血病與其他腫瘤的主要治療手段之一，高效低毒化療藥物的研發(fā)長期以來是腫瘤研究中的熱點，研究發(fā)現(xiàn)，石蒜堿在微摩爾數(shù)量級對U937細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，其IC50值同既往報道的抑制HL-60細(xì)胞細(xì)胞增殖的濃度相近Bcl-2家族主要包括抗凋亡蛋白如bcl-2、bcl-xL及促凋亡蛋白如bax、bid、bad等。細(xì)胞凋亡的發(fā)生與抗凋亡蛋白下調(diào)、促凋亡蛋白升高及蛋白質(zhì)線體轉(zhuǎn)位(如bax)有關(guān)17。既往報道石蒜堿誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡時下調(diào)Bcl-2蛋白表達并上調(diào)bax蛋白表達。研究發(fā)現(xiàn)，石蒜堿誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡bcl-2蛋白表達無明顯變化，但MclI和bcl-XL蛋白表達均有下降，其中以Mcl1蛋白減少最為明顯；石蒜堿對Mcl一1蛋白的抑制作用先于PARP剪切(PARP剪切是化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的一個早期指標(biāo)，而對bcl-XL蛋白的抑制作用則發(fā)生在PARP剪切后18。提示Mcl一1蛋白可能真正介導(dǎo)了石蒜堿對U937細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。Mcl-l基因是在篩選TPA(佛波酯)誘導(dǎo)人髓樣白血病細(xì)胞系ML1分化的早期反應(yīng)基因時發(fā)現(xiàn)的，近來研究發(fā)現(xiàn)，Mcl-1基因在原發(fā)性或耐藥白血病細(xì)胞中高表達。另有體外實驗表明：Md-1過度表達可使細(xì)胞抵抗紫外(uv)及多種化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡L；利用抑制MclI轉(zhuǎn)錄的小分子化合物或SiRNA、Antisense寡核苷酸降低Mcl一1表達后，腫瘤細(xì)胞可被誘導(dǎo)凋亡19。因此，以抑制MclI基因為靶點的化療藥物已成為抗白血病治療的研究熱點。Mcl1蛋白半衰期較短，具有翻譯阻斷作用的高三尖杉酯堿可明顯抑制MclI蛋白表達并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究表明，石蒜堿可能對細(xì)胞蛋白質(zhì)合成有抑制作用，機理為在蛋白翻譯水平上降低Mcl一1表達后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡20。低濃度的石蒜堿在體外可明顯抑制Mcl1蛋白表達并誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，石蒜堿可能對異常高表達MclI蛋白的相關(guān)腫瘤有治療應(yīng)用前景。  5.1.5對乳腺癌的抑制     乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性疾病，早期乳腺癌患者的無病生存期和總 生存期已經(jīng)有了明顯的提高，經(jīng)合理治療，90以上可獲長期生存。系統(tǒng)的治療對晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者收效甚微，目前，化療藥物仍是治療晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌的主要策略。天然藥物由于資源豐富，藥理作用機制多樣，成為發(fā) 現(xiàn)抗腫瘤新藥的主要源泉21。石蒜堿是從我國廣泛分布的多年生草本植物石蒜鱗莖中分離出的一種化學(xué)單體，屬于異喹啉類植物堿，它是石蒜科植物抗腫瘤 生物堿主要成分之一。下面石蒜堿降低人乳腺癌細(xì)胞MCF-7存活率及其機制。    石蒜堿作為石蒜屬植物的抗腫瘤有效成分之一，其藥理作用已經(jīng)有了一定的研究。研究表明，石蒜堿及其鹽酸鹽對大鼠W-256肉瘤細(xì)胞的生長有明 顯抑制作用22。其在體內(nèi)外可明顯抑制人早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)HL與0細(xì)胞凋亡；在體內(nèi)實驗中，石蒜堿對白血病小鼠模型也有良好 的治療作用。而本研究表明，石蒜堿具有對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7同樣有有效的抑制作用。線粒體是細(xì)胞中進行生物氧化并產(chǎn)生能量的場所，它是細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換器，三羧酸循環(huán)、電子傳遞及氧化磷酸化均在線粒體進行，它對維系生命運動至關(guān)重要23。由于線粒體膜上各種離子泵的作用，使線粒體膜內(nèi)外維持著不同的離子濃度梯度，造成了MMP在正常情況下，線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體膜內(nèi)外維持較高的跨膜電壓24。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，線粒體即發(fā)生崩解，MMP也隨之消失。MMP的崩解被許多學(xué)者稱之為細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的先導(dǎo)。多種毒素、細(xì)胞氧化應(yīng)激或缺血、缺氧等病理因素所致細(xì)胞凋亡，均首先發(fā)生MMP崩解。通過檢測線粒體膜電壓可以評價細(xì)胞凋亡程度25。JC-1是一種碳氰化合物類熒光染料，在細(xì)胞內(nèi)以聚合物和單體兩種不同形式存在。在MMP較高時，JC一1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生橙紅色熒光；在MMP較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時Jc1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光26。因為JC一1能較特異地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，只在線粒體膜崩解時才釋放出來，因此檢測結(jié)果可靠，敏感性高，利用流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)JC一1染色的細(xì)胞可以準(zhǔn)確了解細(xì)胞MMP情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石蒜堿可以有效抑制McF-7細(xì)胞增殖并造成其MMP下降，這提示，石蒜堿可以通過損害癌細(xì)胞線粒體功能從而達到對乳腺癌的治療效果。    石蒜堿及其衍生物的抗腫瘤活性已經(jīng)得到確證，而且對石蒜堿抗腫瘤作用機制的研究也較為深入，但由于石蒜堿沒有專利保護，開發(fā)成新藥沒有很大經(jīng)濟效益，而且石蒜堿本身具有局部刺激性，因此有必要對其構(gòu)效關(guān)系進行深入研究，通過對取代基的改變甚至母核結(jié)構(gòu)的改變以發(fā)現(xiàn)活性更強的化合物27。近年來，計算機輔助藥物篩選技術(shù)在抗腫瘤藥物篩選中已經(jīng)有應(yīng)用，我們可以探索應(yīng)用此技術(shù)進行此類化合物的快速篩選，已發(fā)現(xiàn)活性更強、靶點明確的抗腫瘤藥物。  5.1.6抗病毒、抗菌作用機制的研究  石蒜堿對多種RNA和DNA病毒具有抗病毒活性，Gabrielsen B等副研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿對日本腦炎病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒等多種病毒顯示出體外抑制活性。石蒜堿對脊髓灰質(zhì)炎病毒(vv)、皰疹病毒(HSV)、柯薩奇病毒B2也有抑制作用n ，抑制強度與濃度有關(guān)，其抗HSV病毒的機制與抑制DNA多聚酶有關(guān)，也有研究認(rèn)為，石蒜堿延遲病毒生長和降低病毒生成總量的作用與阻斷病毒蛋白質(zhì)合成有關(guān)28。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對石蒜堿的抗病毒作用進行了進一步研究，在MT4細(xì)胞上研究石蒜堿的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)石蒜堿對HIV1病毒復(fù)制有明顯抑制用，石蒜堿有抗人類急性呼吸道綜合癥相關(guān)冠狀病毒(SARSCoV)的作用，但其作用機制還不清楚，需要進一步研究29。偽石蒜堿也有抗病毒作用，可以使顱內(nèi)接種淋巴細(xì)胞絨毛腦膜炎病毒及腦心肌炎病毒的小鼠死亡率降低，也有抗日本乙型腦炎病毒作用。對于大鼠感染Rauscher病毒引起的白血病，偽石蒜堿也有較好的療效30。有學(xué)者通過合成一些衍生物進行構(gòu)效關(guān)系研究表明，六氫吲哚環(huán)和環(huán)上的兩個羥基可能是抗病毒的必須結(jié)構(gòu)31。由于石蒜堿具有較好的抗病毒作用，因此有必要對其抗病毒作用的構(gòu)效關(guān)系進行深入研究。石蒜屬植物中的生物堿類化學(xué)成分具有抗菌活性，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，文殊蘭堿型的生物堿具有廣譜抗菌活性3、47，文殊蘭堿對金黃色葡萄球菌具有抑制活性的作用；ainarbellisine和文殊蘭堿具有抗大腸桿菌活性的作用；小星蒜堿石蒜寧堿型生物堿具有抗白色念珠菌活性的作用。石蒜堿型生物堿石蒜堿對脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、SARS 冠狀病毒和麻疹病毒具有抑制作用，并且石蒜屬植物生物堿類化學(xué)成分還具有抗病毒活性；文殊蘭型生物堿中網(wǎng)球花胺、網(wǎng)球花定對HIV-1 病毒具有抗反轉(zhuǎn)錄活性，水仙花堿型水仙堿、石蒜寧堿型高石蒜堿對 HIV-1 病毒也具有抗反轉(zhuǎn)錄活性33。  5.1.7抗寄生蟲、抗瘧疾作用  石蒜堿及其1，2二乙酰氧基取代物對體外培養(yǎng)的氯喹敏感型瘧原蟲DIO和氯喹耐藥型瘧原蟲FAC8都具有抗瘧疾活性，但活性比氯喹和青蒿素弱34；也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿對氯喹耐藥型瘧原蟲的療效比氯喹敏感型瘧原蟲更好，通過與其它具有抗瘧疾活性的石蒜科生物堿進行結(jié)構(gòu)比較，推測石蒜堿的抗瘧疾活性可能與分子中的亞甲二氧基苯和不與甲基相連的叔胺有關(guān)。  5.1.8抗炎活性     石蒜堿對未去除腎上腺的正常大鼠蛋白性關(guān)節(jié)炎有顯著的預(yù)防作用，但對去除腎上腺大鼠的蛋白性關(guān)節(jié)炎則沒有預(yù)防作用，由此可見，石蒜堿的抗炎作用可能與腎上腺有密切關(guān)系，石蒜堿可以抑制鈣衛(wèi)蛋白引起的細(xì)胞凋亡，并恢復(fù)被鈣衛(wèi)蛋白抑制的DNA合成能力，其作用機理可能是石蒜堿抑制了鈣衛(wèi)蛋白介導(dǎo)的蛋白合成，石蒜堿具有類似結(jié)構(gòu)的石蒜西丁醇(1ycoricidine)對由鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用比石蒜堿強10倍以上(IC50=0001001 ugmL)，動物實驗表明，石蒜西丁醇對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度具有明顯的抑制作用，這提示我們石蒜堿、石蒜西丁醇可以作為一種具有新的作用機制的候選抗炎藥物，而且有必要合成更多的衍生物，研究其構(gòu)效關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)作用更強的抗炎藥物35。   5.1.9心血管系統(tǒng)      二氫石蒜堿是從石蒜屬植物石蒜中提取的石蒜 堿經(jīng)氫化而獲得的一種異喹啉類生物堿 ,是非膽堿 酯酶抑制劑,有受體阻斷作用。二氫石蒜堿對大鼠去甲腎上腺素的升壓作用沒有明顯的影響 ,但是可以減弱腎上腺素的升壓作用 ,其降壓機理主要是 阻止兒茶酚胺的釋放。蔣詩琴等 3 觀察了二氫石 蒜堿對 Wistar大鼠的乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧 /復(fù)氧 損傷的保護作用 ,認(rèn)為其作用在一定范圍內(nèi)呈劑量 依賴關(guān)系, 機制可能與其阻斷 、 受體、抑制心肌 細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。藍星蓮等 4 采用家兔 離體基底動脈 (BA)、胸主動脈 (TA)及心室乳頭肌 (PM)標(biāo)本 ,記錄二氫石蒜堿對其張力的影響 , 觀察 其對家兔腦血管的選擇性作用。認(rèn)為二氫石蒜堿對 BA有明顯的選擇性作用 ,在 BA可能存在使該血管 平滑肌收縮的 受體亞型和使之舒張的 受體。 二氫石蒜堿作用可能與對這些受體的阻斷作用相 關(guān) ,這些選擇性作用可能有助于改善缺血區(qū)的腦血 流。張秋芳等 5 用大鼠離體海馬腦片研究了二氫 石蒜堿在中樞的作用及與去甲腎上腺素能系統(tǒng)的關(guān) 系。實驗結(jié)果表明, 二氫石蒜堿在中樞有阻斷、 受體的作用, 并在低濃度對受體比較敏感而高濃 度對受體阻斷作用強, 為以后二氫石蒜堿應(yīng)用于 臨床提供了部分實驗依據(jù)37。二氫石蒜堿和加蘭他敏 兩種藥物對東莨菪堿所致小鼠在跳臺測試中的錯誤 次數(shù)似有減少,兩藥聯(lián)用能明顯促進正常小鼠學(xué)習(xí) 記憶獲得;對亞硝酸鈉所致的記憶鞏固障礙,均能顯 著改善 ,兩者聯(lián)用效果更明顯, 提示二氫石蒜堿不僅可擴張血管、降低血壓 ,可能還有改善腦循環(huán)等作用。另外,石蒜倫堿對蟾蜍心臟有抑制作用,石蒜堿 則先興奮后抑制。石蒜堿對麻醉大鼠、貓、犬及兔均 有降壓作用 ,藥理學(xué)機制是直接擴張外周血管及抑 制心臟。5.2.0其他作用      石蒜堿對小鼠及家兔有明顯鎮(zhèn)靜作用，并能延長巴比妥類藥物的睡眠時間，石蒜堿的鎮(zhèn)痛作用比阿司匹林強。石蒜堿對人工致熱家兔有明顯解熱作用，但口服解熱作用則慢而微弱38。二氫石蒜堿有改善小鼠缺氧所致的學(xué)習(xí)和記憶障礙的作用。石蒜堿對經(jīng)產(chǎn)或已孕家兔和豚鼠子宮的興奮作用顯著，而對成年大鼠子宮小劑量呈現(xiàn)微弱的興奮作用，大劑量呈現(xiàn)明顯的抑制作用。國外研究發(fā)現(xiàn)，石蒜堿還是一種植物生長抑制劑，它能夠抑制動植物維生素C的合成，從而抑制多種植物的正常生長。并且石蒜屬植物的生物堿類化學(xué)成分還具有降血壓的作用，石蒜寧堿、加蘭他敏、9-O-去甲高石蒜堿、高石蒜堿對小鼠顯示出降血壓作用3、43。研究發(fā)現(xiàn)二氫石蒜堿可以通過拮抗外周 、 受體，從而改善能量代謝，進而保護心肌細(xì)胞缺氧損傷3、44。研究發(fā)現(xiàn)水仙花堿型生物堿水仙花堿、石蒜堿型生物堿 1-O-乙酰基石蒜堿具有一定的抗抑郁癥作用3、45。小星蒜堿 、 montanine 、 布 蕃 君 、 martidine 及 O- methylmartidine 也具有抗抑郁和抗驚厥作用3、46。6生態(tài)效益和人工繁殖6.1生態(tài)效益石蒜類植物的環(huán)境適應(yīng)能力很強，鱗莖增殖能力較強，生長強健，耐寒，易栽培，可粗放管理39。園林中宜培植在草坪，林園、灌木叢、角隅及路邊，水邊，也可以用來布置中長期花壇。石蒜屬植物生態(tài)學(xué)特性較一致，具備早生結(jié)構(gòu)和習(xí)性，喜濕潤氣候不適于濕潤土壤，具有夏眠習(xí)性，這也為研究該屬的起源中心提供一定的依據(jù)。6.2人工繁殖石蒜屬植物既是優(yōu)良的地被花卉，也是理想的切花和盆栽材料，而且有較高的藥用價值，并可作為化工生產(chǎn)原料，今年來市場需求日益增加。為滿足市場需求，對石蒜屬植物進行人工繁殖的研究也越來越多。李玉萍等采用人工切割方式擴大石蒜種球，繁殖效果良好40；張露等認(rèn)為中國石蒜的切割繁殖系數(shù)最高，換錦花次之，石蒜和忽地笑最低，雙鱗片繁殖以石蒜的繁殖系數(shù)最高，且鱗片繁殖時應(yīng)采用外、中部鱗片；何樹蘭等研究發(fā)現(xiàn)，石蒜地上部分衰老期與花期（6-9月）是組織培養(yǎng)取材的最佳時期，誘導(dǎo)率最高，且組培中不形成愈傷組織，而直接產(chǎn)生不定芽。6.3展望 石蒜屬植物的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和綠化價值日益受到重視，除園林中用以觀花栽植外，更可以用作盆花與切花。目前，雖然人們?nèi)找孀⒅仄渌幱煤捅＝》矫娴难芯?，但以明了其藥用價值的只有幾種41。因此，隨著對其化學(xué)成分研究的深入，應(yīng)加大該屬植物的藥用開發(fā)。我國石蒜屬植物資源豐富，在保護野生資源的同時，還應(yīng)加強引種馴化和人工繁殖工作，為石蒜植物的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。另外，石蒜屬植物大都為肉質(zhì)，具有肥大的鱗莖，并且含有大多的多糖、氨基酸和微量元素，對其進行脫毒之后，可制成口感很好，具有保健價值的食品。同時，其高含量的淀粉也可用于加工酒精和造紙的糊料，提取的植物膠可替代阿拉伯膠，還可以將其加工成數(shù)算粉，用于建筑材料，成為新一代的無污染的化工原料。因此，今后應(yīng)重視石蒜屬植物在食品及化工方面的開發(fā)。7小結(jié)石蒜屬植物作為我國傳統(tǒng)中藥材，具有分布廣泛、資源豐富等特點，石蒜屬植物富含大量生物堿類化學(xué)成分，隨著近年來石蒜屬植物生物堿類化學(xué)成分、藥理作用的深入研究，生物堿的種類、數(shù)量不斷增加，藥理作用不斷豐富，但大多數(shù)石蒜植物生物堿類化學(xué)成分的研究還是處于起步階段，藥理作用機制還不明確，因此有必要對石蒜植物生物堿類化學(xué)成分、藥理作用進行深入系統(tǒng)的研究，為研發(fā)高效低毒的藥物提供理論依據(jù)，使石蒜植物更好的發(fā)揮其藥用價值。參考文獻1王歡，王躍虎，陳麗娟，龍春林石蒜屬植物生物堿成分研究進展.J天然產(chǎn)物研究與開發(fā). 2012, 24(5):691-697.2季宇彬，辛國松，曲中原，鄒翔，于淼石蒜屬植物生物堿類化學(xué)成分和藥理作用研究進展.J.中草藥,2016(1).3李娟，皮慧芳，常航，張鵬，阮漢利.石蒜屬植物忽地笑的生物堿類成分提取和結(jié)構(gòu)鑒定.J.中國藥師,2013,16(6):809-811.4李圣各，蘇鈺清，馬冬珂，李建勇，郭佳.唐松草屬植物中生物堿類化學(xué)成分和藥理作用的研究進展.J.現(xiàn)代藥物與臨床,2014,29(3):312.5張秀娟，于淼，賈未玲，季宇彬，鄒翔，石蒜屬植物中石蒜堿的藥理作用研究.J.中醫(yī)學(xué)與中藥學(xué)2015.12.6Feng 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