生物實(shí)驗(yàn) 免疫共沉淀

完成WB實(shí)戰(zhàn)指南后，朋友曾央分享點(diǎn)免疫共沉淀方面的咚咚；當(dāng)時(shí)不得不回絕。因?yàn)?，WB指南是基于這些年的回復(fù)的匯總，基本上方方面面的問(wèn)題都有提及，只需要做些串聯(lián)；而論及coIP，目前在國(guó)內(nèi)還不太普及，盡管它已經(jīng)是生化領(lǐng)域最基本的技術(shù)之一。因此，再想寫(xiě)這么個(gè)長(zhǎng)篇頗耗時(shí)間，于我的時(shí)間和精力太為難；不過(guò)，今天是個(gè)特殊的日子，湊湊熱鬧吧。人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有虧欠，也許這就是上帝的公允吧。在自己最擅長(zhǎng)的地方找點(diǎn)成功的感覺(jué)吧，當(dāng)然我的失敗也只是因?yàn)闆](méi)有更多的時(shí)間。哎！扯遠(yuǎn)了玩coIP也玩了5年多了，因?yàn)樯鲜志褪亲铍y的B蛋白結(jié)合量多少的變化（假定IP A蛋白）而非檢測(cè)B蛋白的有無(wú)，說(shuō)句吹牛皮的話，在我們這個(gè)小領(lǐng)域三家最強(qiáng)的lab唯有我們敢于通篇基于這種檢測(cè)手段，所以，對(duì)于coIP算是非常得有心得了。以下論述基于最難的B蛋白結(jié)合水平變化的檢測(cè)，所以部分實(shí)驗(yàn)操作非?？燎螅粚W(xué)會(huì)這個(gè)，其他就是小菜了；所以，這也算一個(gè)進(jìn)階篇。一.樣品的制備。如WB指南，在這里我最強(qiáng)調(diào)從制備樣品開(kāi)始的一致性。如果不觸及細(xì)胞的凋亡或死亡，那么任何處理組樣品和ctrl最后的終體積應(yīng)該保持一致；如果細(xì)胞有大量凋亡或死亡，可以通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)體積對(duì)樣品的體積粗略定量后再加裂解液，一般可以把誤差控制在WB的檢出范圍以下，基本保持樣品的均一；組織樣品可以通過(guò)稱(chēng)重添加相應(yīng)體積比的裂解液。裂解液的配方可以采用WB指南里給出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF)此裂解緩沖液裂解條件相對(duì)溫和，適合后續(xù)的coIP分析。“不過(guò)”用它做coIP有明顯的缺陷；要理解此配方的缺陷，我們先聊聊如何在coIP實(shí)驗(yàn)中“作偽”。偽造結(jié)果，也分為單純性造假和技術(shù)型偽造。撇去前者，從技巧上來(lái)講，如果要想獲得設(shè)定、預(yù)想的相互作用結(jié)果，可以從幾個(gè)角度著手此類(lèi)結(jié)果可重復(fù)。a.在低鹽離子裂解液中進(jìn)行IP。很多蛋白復(fù)合體對(duì)鹽濃度敏感，但敏感性有強(qiáng)弱之別。通常來(lái)說(shuō)，真實(shí)存在著的蛋白復(fù)合體能耐受生理鹽（0.15M）或更高濃度，即在生理鹽濃度下不會(huì)解體。具體如，某種CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高鹽而不解體，即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高鹽。因此，了解一個(gè)蛋白復(fù)合體對(duì)鹽濃度的耐受，既是一個(gè)幫助判斷蛋白復(fù)合體是否真實(shí)存在的一個(gè)重要依據(jù)，更是一個(gè)非常重要的生化數(shù)據(jù)；對(duì)某些體外生化反應(yīng)的蛋白原料的純化制備也是很重要的輔助依據(jù)。例如，純化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用鹽濃度漂洗，則最低需0.6M以上以解離CKI。所以，在生化領(lǐng)域的coIP分析中，很多實(shí)驗(yàn)體系的鹽濃度是比生理鹽濃度更高的。當(dāng)然，不排除某些弱相互作用需要生理鹽濃度，但這種情況不多見(jiàn)；也容易跟瞬時(shí)的相互作用混淆，某些實(shí)驗(yàn)中的弱相互作用實(shí)際是由于生化反應(yīng)的瞬時(shí)性，且缺乏有效的截留、富集手段，諸如酶和底物。很多非生化領(lǐng)域的，喜歡在生理鹽或更低鹽濃度下進(jìn)行coIP，這大大增加了假陽(yáng)性的幾率很多蛋白間非特異性的黏粘被記錄下來(lái)。這也成為了獲得“設(shè)定的”相互作用的有效手段。b.過(guò)表達(dá)?，F(xiàn)在已經(jīng)存世的相當(dāng)多的實(shí)驗(yàn)論文和數(shù)據(jù)，其蛋白復(fù)合體相互作用的數(shù)據(jù)是通過(guò)過(guò)表達(dá)，甚至原核GST pulldown獲得的；筆者認(rèn)為，在閱讀這類(lèi)文獻(xiàn)時(shí)，大家要特別小心，多長(zhǎng)一個(gè)心眼即始終抱懷疑的態(tài)度。并非說(shuō)一定不可取，但是有一點(diǎn)很明確，這樣的數(shù)據(jù)送到我們手里，首先我們會(huì)要求對(duì)方補(bǔ)充內(nèi)源性蛋白相互作用的證據(jù)，否則該結(jié)果一律不采信。在WB指南里面我提過(guò)，血清中豐富的BSA可以被任意抗體識(shí)別（其實(shí)也是一種相互作用），那么同理高豐度的兩種或多種蛋白人為拼湊到一起，為什么不可以非特異性的黏粘或者發(fā)生弱的相互作用呢？因此，如果想要“特定”的相互作用，可以考慮過(guò)表達(dá)所有的蛋白，就是核蛋白結(jié)合胞漿蛋白甚至膜表面受體也不稀奇。c.不添加NP40一類(lèi)表面活性劑，削弱對(duì)非特異性結(jié)合的拮抗。NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特異性的蛋白相互作用，提高coIP的特異性。因此，減少或不添加NP40也可以輔助“預(yù)期”目的。實(shí)際上，掌握a、b兩點(diǎn)技巧，基本上可以“無(wú)往而不勝”徹底搞定一切“想要的”相互作用?；谝陨系脑?，如果想獲得切實(shí)可靠的相互作用數(shù)據(jù)，那么裂解液的選取相當(dāng)講究。1.首先鹽濃度至少0.15M或以上。鹽濃度主要指Na鹽濃度。有人會(huì)問(wèn)為什么不是鉀鹽？因?yàn)殁淃}會(huì)更容易跟某些試劑（或離子）形成沉淀，諸如SDS，因此在某些情況下，鉀鹽會(huì)對(duì)后續(xù)的某些實(shí)驗(yàn)帶來(lái)未知的麻煩，所以一般鹽濃度指Na鹽。鹽濃度過(guò)低對(duì)某些與染色體結(jié)合較牢的蛋白的抽提（非破膜的溫和裂解）效率也較差，可能會(huì)丟失部分信息；而鹽濃度過(guò)高又會(huì)造成某些相互作用較弱的復(fù)合體解體，因此，通常選擇0.150.3M做細(xì)胞裂解。純化蛋白通常選取0.6M以上進(jìn)行IP。小技巧：最初幾遍的漂洗buff要和IP時(shí)的鹽濃度相同。經(jīng)驗(yàn)上，純化蛋白時(shí)，若用低鹽裂解細(xì)胞、高鹽漂洗去雜質(zhì)，蛋白丟失較多；所以，一般如前所述。當(dāng)然，也可以高鹽裂解低鹽漂洗，但是對(duì)除雜質(zhì)不利。2.通常IP體系中NP40含量0.20.5%。NP40在0.51.0%時(shí)，染色體很容易析出（很黏，成膠狀會(huì)裹住beads，同時(shí)粘下很多蛋白），用這樣的裂解液破碎細(xì)胞則可能需要超聲。通常由于習(xí)慣上避免增加不必要的操作，所以在非必要的情況下，選擇前述的濃度區(qū)間。3.可適當(dāng)添加EDTA，螯合金屬離子保護(hù)DNA和蛋白。特殊情況下還可選擇添加EGTA，螯合Ca2+研究鈣相關(guān)蛋白。此外，裂解液中甘油濃度一般介于15%-20%之間。4.很多市售或自制的裂解液過(guò)于溫和，需要考慮采用機(jī)械或者超聲等手段提高裂解效率（超聲要慎用，可能破壞弱的相互作用）。但是，有些時(shí)候裂解液的凍融又可能影響某些弱的相互作用，所以不太建議凍融裂解液即最好裂解液制備好后立即進(jìn)行coIP。當(dāng)然，如果證實(shí)凍融無(wú)影響可考慮將蛋白樣品保存-80度待用，這對(duì)實(shí)驗(yàn)日程的安排會(huì)更平易。5.裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。前幾日回復(fù)一貼子，不知道出于什么動(dòng)因該LZ主動(dòng)稀釋裂解樣品的蛋白濃度再I(mǎi)P，所幸不是做coIP。上面提到過(guò)表達(dá)會(huì)制造相互作用的假象，反過(guò)來(lái)說(shuō)蛋白濃度過(guò)稀，某些相互作用就測(cè)不到（不一定是弱的相互作用）。因此，細(xì)胞的裂解效率會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通常細(xì)胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達(dá)7-8mg/ml左右，但是更常規(guī)的現(xiàn)象是達(dá)不到這種濃度；當(dāng)然不是說(shuō)低于7-8mg/ml就不能進(jìn)行coIP，只是需要考慮這一因素。因此，在多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細(xì)胞裂解液。【補(bǔ)充1】：切記！實(shí)驗(yàn)要先有結(jié)果再來(lái)挑戰(zhàn)極限！在不少人的提問(wèn)給出的流程中，其開(kāi)始的樣品量往往是以6 well或者60mm dish為單位的；不否認(rèn)某些蛋白或復(fù)合體確實(shí)可以在如此苛刻的條件下完成coIP。但是，更多的時(shí)候不是這樣子的。以我自己研究的復(fù)合體為例，其內(nèi)源性IP最低起始細(xì)胞數(shù)是40-50% confluence的145mm dish；比這個(gè)數(shù)目更低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就很不穩(wěn)定甚至無(wú)信號(hào)。當(dāng)某些藥品、試劑非常昂貴時(shí)，鄙人才會(huì)勉為其難。否則，一律2 dishes 100% confluence，可以elute成30ul跑兩次；相互作用微弱時(shí)，15ul僅跑一次；再弱，多養(yǎng)幾塊板（CE增加抗體和beads仍可保持不變，因此只浪費(fèi)培養(yǎng)基總比浪費(fèi)一個(gè)冗長(zhǎng)的時(shí)間走麥城要好）。后續(xù)若為質(zhì)譜分析，需考慮小規(guī)模量產(chǎn)。二、IP前的準(zhǔn)備工作：coIP:分為內(nèi)源性蛋白的相互作用和非內(nèi)源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之間以及外源拖內(nèi)源蛋白）。非內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要是通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，通常為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)、提高IP效率會(huì)讓外源蛋白帶上標(biāo)簽（tagged；這也是沒(méi)有相應(yīng)的可用于IP的內(nèi)源蛋白抗體之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。a.His-tagged主要用于純化蛋白。有些人喜歡用His-tagged蛋白然后進(jìn)行coIP，實(shí)際上它存在潛在的隱患。當(dāng)初鄙人用Sigma a-His（鼠單抗；免費(fèi)廣告）WB外源蛋白發(fā)現(xiàn)CE里面一塌糊涂（帶型漂亮就是非常多的帶），那時(shí)候還抱怨這個(gè)抗體特異性不好。后來(lái)，當(dāng)了解到很多蛋白會(huì)有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因?yàn)樾r(jià)非常好，所以很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識(shí)別。同理，如果用Ni-NTA beads去PD His-tagged的蛋白，完全有可能PD那些內(nèi)源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而這樣的蛋白還非常多。那么，當(dāng)初開(kāi)發(fā)His tag的主要目的，個(gè)人認(rèn)為主要是可以用廉價(jià)的化學(xué)試劑洗脫，且Ni-NTA beads這類(lèi)非抗體類(lèi)的beads成本低廉，可大量工業(yè)生產(chǎn)。因此，用這個(gè)tag去生產(chǎn)有活性的蛋白是首選。b.tandem-tagged不能用于分析鈣調(diào)信號(hào)通路。tandem tag實(shí)際上從成本角度和His tag差不多，洗脫試劑價(jià)格低廉，因此可用于大規(guī)模PD之后的質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含鈣調(diào)蛋白相互作用domain，天然會(huì)結(jié)合鈣信號(hào)相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號(hào)蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限。當(dāng)然，筆者不太清楚近年來(lái)該方法有無(wú)改進(jìn)，但正是由于引入鈣調(diào)domain才實(shí)現(xiàn)了降低成本的目的，因此猜測(cè)可能性不大。c.Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然會(huì)有天然的干擾，應(yīng)用略有局限；相較后兩者是人工合成專(zhuān)門(mén)用于tagged蛋白（有相應(yīng)的專(zhuān)利，因此目前無(wú)論抗體或交聯(lián)好的beads價(jià)格都非常昂貴），因此干擾最小、最常用。如需進(jìn)一步細(xì)致區(qū)分，a-Flag效價(jià)比a-HA略高，因此更適合IP。當(dāng)然，公司仍在努力尋找效價(jià)更好的a-HA以及IP HA的抗體（Flag系Sigma專(zhuān)利，因此目前只能忍受其過(guò)高的定價(jià)）。那么，之前頗流行的a-HA鼠源單抗（其clone名稱(chēng)為12CA5）為何被潛在地摒棄了？原因大概是：該克隆株可以輕易獲取，流傳甚廣，因此可以取腹水自制；效價(jià)不高，特異性很差。尤其是特異性的問(wèn)題，用該抗體去交聯(lián)的beads做coIP，隱患很大（可以輕易PD非常濃的非特異性蛋白）因此，購(gòu)買(mǎi)商品化a-HA beads時(shí)，請(qǐng)仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明（避開(kāi)12CA5系列）。還有GST等等，不一一列舉了。d.tag的位置。將tag構(gòu)建到蛋白的N端還是C端，也是一個(gè)潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號(hào)肽，如果將tag構(gòu)建到N端，則外泌時(shí)會(huì)被信號(hào)肽酶連同信號(hào)肽一起切除；所以這時(shí)必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時(shí)候?qū)ag構(gòu)建在C端會(huì)影響蛋白原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時(shí)是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時(shí)候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。因此，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時(shí)候是N端、C端tagged同時(shí)分別構(gòu)建，以備萬(wàn)一。內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要依靠抗體IP，WB或者質(zhì)譜分析。另外一條途徑，是用外源性蛋白的coIP指代內(nèi)源性蛋白，上文提到的tandem-tag技術(shù)的目的就是為了實(shí)現(xiàn)這種可能。它的核心是將外源性蛋白的過(guò)表達(dá)降低極低水平用于模擬體內(nèi)環(huán)境。實(shí)際上，在構(gòu)建外源過(guò)表達(dá)體系的時(shí)候，通常可以得到一系列表達(dá)水平差異的穩(wěn)定單克隆，可以通過(guò)進(jìn)一步篩選獲得外源與內(nèi)源相加與原內(nèi)源蛋白水平相當(dāng)?shù)募?xì)胞株（在細(xì)胞調(diào)控承受的范圍以?xún)?nèi)，內(nèi)源性蛋白水平會(huì)因?yàn)橄鄳?yīng)的外源蛋白表達(dá)而適當(dāng)下調(diào)），這樣的細(xì)胞株可以用于模擬內(nèi)源性蛋白的相互作用；因?yàn)槔碚撋衔锤淖兗?xì)胞的生理特異，相應(yīng)的生命過(guò)程仍受內(nèi)源因素調(diào)控。當(dāng)然構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞株需要轉(zhuǎn)染并篩選，又因?yàn)橐刂票磉_(dá)量水平，篩選工作耗時(shí)更長(zhǎng)；并且細(xì)胞狀態(tài)會(huì)因?yàn)閭鞔^(guò)多而有些改變。因此，絕對(duì)的內(nèi)源性蛋白的相互作用仍是一個(gè)不可或缺的數(shù)據(jù)，尤其對(duì)一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白復(fù)合體。IP內(nèi)源性蛋白首先要確認(rèn)相應(yīng)的抗體是否能夠用于IP。能夠用于IP的抗體，通常其識(shí)別區(qū)域恰是天然狀態(tài)下靶蛋白暴露于外的區(qū)段，常為疏水性結(jié)構(gòu)域；因此在自己制備抗體的時(shí)候要更多考慮這個(gè)因素，至于商品化的要仔細(xì)閱讀說(shuō)明。在確定抗體可以用于IP A蛋白以后，抗體投入量如何掌握呢？通常情況下0.1ug-3ug較常用（純化的抗體），其變化取決于抗體的效價(jià)，但通常未知情況下0.5ug或1ug是最常用。一般如果樣品易制備則盡量用樣品過(guò)飽和抗體，讓投入抗體能物盡其用；相反，通常1ug抗體已經(jīng)是過(guò)量的。另外一個(gè)需要考慮的因素是B蛋白的大小，尤其B蛋白已知。當(dāng)B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的時(shí)候，問(wèn)題會(huì)比較復(fù)雜。因?yàn)樵谧詈笠徊较疵摰倪^(guò)程，很容易將輕鏈和重鏈帶入到IP終產(chǎn)物，它將嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。解決方案：1. IP外源tagged-A蛋白，洗脫盡量用相應(yīng)的peptide，一方面提高特異性，另一方面由于洗脫條件溫和，重鏈和輕鏈脫落也會(huì)較少；在IP前，尤其對(duì)于新Flag、HA beads可以用washing buffer或者低pH Glycine-HCl漂洗一下beads，把結(jié)合不牢的重鏈和輕鏈先洗掉。此外，F(xiàn)lag、HA-beads通常是鼠抗，那么IB B蛋白的抗體應(yīng)該選用兔抗。針對(duì)beads的新舊，反過(guò)來(lái)說(shuō)，采用再生的舊beads有利于避免輕重鏈的干擾，且IP前的封閉可以省去不要指望高鹽、酸洗能徹底去除已經(jīng)非特異結(jié)合到beads上的雜質(zhì)，通常這些蛋白都比較黏。高鹽、大量純化蛋白時(shí)，采用再生的beads可以獲取即便銀染，背景仍非常干凈的高純度蛋白樣品。2. IP內(nèi)源性蛋白，尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脫或者SDS LB煮beads（后者重、輕鏈更嚴(yán)重），如B蛋白為60KDa即能與55KDa重鏈分開(kāi)時(shí)，且抗體效價(jià)許可的前提下，降低抗體投入量會(huì)顯著減弱重、輕鏈信號(hào)，從而不會(huì)使得B蛋白信號(hào)不致被重鏈信號(hào)吞沒(méi)；若有條件再配合交錯(cuò)抗體種屬來(lái)源，即IP A蛋白的抗體為兔抗，IB B蛋白用兔抗以外任何一種諸如鼠抗、羊抗；反之亦然。即使交錯(cuò)抗體的種屬，實(shí)際上當(dāng)重輕鏈脫落過(guò)多時(shí)（尤其是重鏈），在IB的時(shí)候它符合WB實(shí)戰(zhàn)指南提到的雜蛋白過(guò)濃會(huì)非特異結(jié)合任意抗體，這在coIP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析中要格外小心。有人會(huì)說(shuō)可以用未免疫的IgG做陰性對(duì)照，但是偶爾會(huì)發(fā)生一些未知意外，恰好IgG的重鏈沒(méi)有顯影（畢竟這不是抗原抗體特異性結(jié)合）?！綛TW：偶爾這樣的結(jié)果還能重復(fù)出來(lái)，但是反過(guò)來(lái)IP B蛋白，IB A蛋白可能就100%失敗。所以，當(dāng)?shù)鞍追肿恿拷咏亍⑤p鏈的時(shí)候，下結(jié)論要格外小心，除嚴(yán)格陰性、陽(yáng)性對(duì)照外，reverse IP的結(jié)果也很重要。最好加一個(gè)不相干的蛋白的同種屬的抗體做陰性對(duì)照】beads封閉和樣品的preclear：如果采用新beads，beads的封閉就顯得非常必要。封閉用1-5mg/ml BSA（ChIP還要加魚(yú)精DNA）扔buffer里一直靜置就好了；若臨時(shí)添加可考慮翻轉(zhuǎn)半小時(shí)；樣品preclear用protein A beads翻轉(zhuǎn)半小時(shí)。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，雜蛋白若是很黏怎么處理都只是相對(duì)好一些。所以，IP、漂洗的鹽濃度影響更大。coIP：抗體劑量上文提過(guò)了；其他flag、protein A等等beads一般用10ul足夠了，偶爾根據(jù)需要微調(diào)，諸如過(guò)表達(dá)純化蛋白?？傊?，一般CE的成本較低，若用CE飽和抗體、beads，只要你抗體、beads和操作始終一致，最后IP的A蛋白能保證一致，結(jié)果有效。干粉狀的beads用IP buffer充分溶脹后離心去beads的碎片；其他液態(tài)的不需要此過(guò)程?，F(xiàn)在市售的商品化beads如sigma flag可不需要IP buffer漂洗直接IP，未發(fā)現(xiàn)對(duì)coIP結(jié)果的明顯干擾。通常，再生的beads由于放置-20度延長(zhǎng)保存期需要加入大量甘油，不漂洗直接使用不容易把beads分勻，從而造成不同tube間初始差異，這時(shí)候會(huì)對(duì)IP結(jié)果影響很大。用抗體做內(nèi)源性IP時(shí)，個(gè)人喜歡抗體2hr+beads 1hr，抗體孵育可過(guò)夜；beads不超過(guò)3hrs（含flag等等標(biāo)簽蛋白IP情況）。這里面提到一個(gè)細(xì)節(jié)，就是先加beads還是先加抗體。在某些情況下，CE離心去除細(xì)胞碎片后的上清是一個(gè)剛好的溶解平衡體系，添加其他物質(zhì)如beads這類(lèi)可作為沉淀凝結(jié)核的物質(zhì)會(huì)破壞原本的溶解平衡；它可能類(lèi)似水蒸氣凝結(jié)成雨水或雪花需要灰塵作為凝結(jié)核，其結(jié)果就是讓一些原本溶解完全的蛋白發(fā)生沉淀。那么，beads翻轉(zhuǎn)越久蛋白會(huì)沉淀越多，而這種沉淀無(wú)法靠漂洗去除干凈，最終進(jìn)入sample從而可以檢測(cè)到任意蛋白的結(jié)合。因此，限制beads翻轉(zhuǎn)孵育時(shí)間非常關(guān)鍵；通常beads孵育1-2hr已經(jīng)充分結(jié)合了。做IP的beads其物理性質(zhì)跟吸附DNA的或諸如Ni-NTA之類(lèi)的差異很大，不需要高速離心，通常臺(tái)式小離心機(jī)4-5K、30sec就足夠了；有時(shí)候忘記了，靜置較久beads已自然沉降甚至不需要離心。在這種情況下，不必要的高速離心只會(huì)給beads施加巨大的離心力，次數(shù)多了beads通通碎裂，嚴(yán)重影響再生beads的質(zhì)量避免一些不必要的操作；當(dāng)然不打算重復(fù)使用就無(wú)所謂了。Beads再生：商品化的beads尤其抗體交聯(lián)的，因?yàn)榭贵w和專(zhuān)利的原因價(jià)格相對(duì)昂貴，那么回收beads并再生就顯得非常必要。保管得好（防霉變），beads可以重復(fù)用20-30次。再生beads沒(méi)有什么特別的，常做生化柱層析的，那簡(jiǎn)直就是家常便飯。IP用beads的再生，也無(wú)非就是高鹽接酸洗再高鹽，最后用IP漂洗buffer復(fù)性，加甘油和NaN3扔-20度長(zhǎng)期保存。高鹽即3M NaCl；酸洗，就是可用做elution buffer的0.1M pH3.0的Glycine-HCl。IP beads尤其抗體交聯(lián)的，由于昂貴再加實(shí)驗(yàn)和回收過(guò)程的損失一般體積不大，所以Biorad公司一種小型塑料的柱層析管用來(lái)再生beads最合適（它是一次性的，但僅僅用于再生beads可以無(wú)限重復(fù)使用）；而常規(guī)的玻璃生化層析柱即便最小號(hào)的也太大，黏壁損失會(huì)很大，beads再生幾次可能就全損失了。再生操作就類(lèi)似做DNA大抽的KIT，加液體到層析柱、控制流速讓其一滴滴流下；再生質(zhì)量可以通過(guò)改變酸、鹽的體積控制，希望干凈點(diǎn)多加一些、多洗幾遍。唯一需要注意的，由于再生流程通常要耗費(fèi)半天時(shí)間，beads太少不值得操作且再生次數(shù)越多黏壁損失也越多；所以，通常都是等回收的舊beads積攢到一定體積再一次性操作。前文提過(guò)，IP用的beads通常不需要離心就會(huì)自然沉降，而積攢舊beads通常是一個(gè)很漫長(zhǎng)的過(guò)程，那么等到?jīng)Q定再生的時(shí)候，beads可能因?yàn)殪o置過(guò)久而已經(jīng)壓擠得非常結(jié)實(shí)；直接重懸beads轉(zhuǎn)移到層析柱里，你會(huì)發(fā)現(xiàn)液體根本流不下來(lái)。因此，對(duì)于靜置很久的舊beads通常在回收前一天高速翻轉(zhuǎn)過(guò)夜，這時(shí)候再把beads轉(zhuǎn)移到層析柱中就會(huì)相對(duì)疏松，酸、鹽洗滌就會(huì)比較流暢。同樣的原因，再生過(guò)程中通常就是流速越來(lái)越慢，再生次數(shù)多的舊beads其內(nèi)含的灰塵、顆粒也較多，可能最后液體就不滴了；這時(shí)候只能用槍反復(fù)吹吸、松松beads。當(dāng)然，這些問(wèn)題都只在beads體積較大的時(shí)候時(shí)明顯，如果本來(lái)就不足1ml，以上就全是廢話。PS:此篇更新會(huì)相當(dāng)慢，盡量不太監(jiān)，請(qǐng)見(jiàn)諒先留個(gè)爪有感于壇友對(duì)本文的關(guān)注：【近況】：非常抱歉最近一直沒(méi)更新，原因主要有二。1. 思路中斷。這篇要全新寫(xiě)，通盤(pán)的概念是有的，但對(duì)于每個(gè)細(xì)節(jié)以及內(nèi)容的銜接很模糊，很難下筆；因?yàn)榧词姑銖?qiáng)著述，按個(gè)人行文的習(xí)慣，前后修改等于重寫(xiě)，時(shí)間需要很久。2. 最近忙于結(jié)尾自己的手頭課題，拼盡全力追求進(jìn)度，連續(xù)多日工作14-16小時(shí)以上，身體已多次出現(xiàn)過(guò)勞體征；還要應(yīng)付研究以外的工作，實(shí)在無(wú)暇顧及這邊。目前，我優(yōu)先保證問(wèn)題的回復(fù)。exciting news: paper accepted!BTW:個(gè)人還是喜歡先回復(fù)再寫(xiě)一個(gè)總結(jié)，因?yàn)榻佑|到的問(wèn)題會(huì)比較全面，諸如最近好幾個(gè)人提問(wèn)時(shí)，給出了詳細(xì)的流程，這很好；可是當(dāng)我看到第一步，就知道下面不用細(xì)看了?？赡芎芏嗳硕枷矚g在刀尖上跳舞玩心跳，不過(guò)我個(gè)人還是喜歡穩(wěn)穩(wěn)當(dāng)當(dāng)先有結(jié)果再來(lái)跳舞為什么很多人起始細(xì)胞量只有6孔板、60mm dish，大家都喜歡這么虐待自己嘛讓心靈承受一次次實(shí)驗(yàn)無(wú)信號(hào)的打擊！？??？?。恳虼?，我也知道在制備CE那一部分需要補(bǔ)充強(qiáng)調(diào)的東西。