高中生物《細胞凋亡》課件4（61張PPT）（中圖版必修1）

歡迎進入生物課堂 細胞凋亡 APOPTOSIS 一 細胞凋亡的研究歷史 1 凋亡概念的形成和形態(tài)學的研究 1972 1972年Kerr等在英國癌癥雜志發(fā)表論文 首次提出細胞凋亡 apotosis 的概念 宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始 2 DNA的降解和內源性核酸內切酶的參與 1987 3 蛋白質水解酶活化的研究 1995 4 細胞膜的變化 1997 5 線粒體的變化和分子生物學的研究 1998 1 相關基因及調控2 信號轉導3 各種分子及其相互作用及相互關系4 疾病機制的闡明 以及新療法的探索及問世 二 概念細胞凋亡是能量依賴的細胞內死亡程序活化而致的細胞自殺 由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程 細胞程序性死亡 programmedcelldeath PCD PCD最初是1956年發(fā)育生物學中提出的概念 是個功能性概念 強調的是其分子生物學和生理功能 一般指生理性細胞死亡 描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預定的 并受到嚴格程序控制的正常組成部分 細胞凋亡與壞死的區(qū)別 細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別特征細胞凋亡細胞壞死誘導因素生理及弱刺激強烈刺激受累范圍單個細胞丟失成群細胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細胞體積減少 固縮增大腫脹染色質凝聚成半月形稀疏成網狀細胞器無明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機降解大分子合成一般需要不需要基因調控有無后果不引起炎癥反應引起炎癥反應意義生理死亡方式病理死亡方式 三 細胞凋亡的生物學特征 形態(tài)學變化生物化學變化DNA片段化大分子的合成tTG 組織轉谷氨酰胺酶 的積累并達到較高的水平 細胞凋亡的形態(tài)特征 1 凋亡的起始 微絨毛的消失 細胞間接觸的消失 與周圍的細胞脫離 細胞質中 線拉體大體完整 染色質固縮 2 細胞質密度增加 線粒體膜電位消失 通透性改變 釋放細胞色素C到胞漿 膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面 3 凋亡小體的形成 核膜核仁破碎 核染色質斷裂為大小不等的片段 與某些細胞器如線粒體一起聚集 為反折的細胞膜所包圍 4 凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬 細胞凋亡DNA的片段化 四 細胞凋亡的過程及機理 接受凋亡信號凋亡調控分子間的相互作用蛋白水解酶 caspases 的活化凋亡的級聯反應 細胞凋亡的兩條通路 膜受體通路 線粒體通路 膜受體的信號轉導 參與死亡受體信號轉導的接頭蛋白 死亡結構域蛋白deathdomainprotein TRADD TNF受體相關死亡結構域蛋白TNF TNFRI 死亡結構域 TRADD 細胞凋亡FADD Fas相關死亡結構域蛋白FasL Fas 死亡結構域 FADD 細胞凋亡RIP 受體相互作用蛋白CRADD 含有死亡結構域的caspase和RIP接頭蛋白MADD 活化MAP激酶的死亡結構域蛋白 一 細胞凋亡的膜受體通路 FASL FAS FADD凋亡誘導復合物 DISC 胞質中游離的caspase8聚集到這個復合物上細胞有足夠caspase8細胞caspase8濃度不夠死亡受體活化 切割BidtBid從胞質到線粒體細胞凋亡CtyC釋放 線粒體與細胞凋亡 線粒體參與細胞凋亡或壞死的途徑釋放caspase活化因子細胞色素C 細胞色素C Apaf 1 caspase9 凋亡體AIF 凋亡誘導因子 Caspase3Apaf 1 凋亡蛋白酶活化因子 二 線粒體通路 五 凋亡的效應分子 細胞凋亡的分子機制雖然還不十分清楚 但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用 細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程 半胱氨酸蛋白酶 水解底物天冬氨酸C端肽鍵 因此又稱之為Caspases 取英文CysteineC asparticacid Asp proteases的詞頭 Caspase家族的結構與分類ICE亞類Caspase蛋白酶 ICE是單核細胞來源的參與成熟的一種蛋白酶 參與凋亡但不起主要作用 Caspase1 Caspase4 Caspase5 Caspase11Caspase12 Caspase13 Caspase14 凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶 Caspase8 Caspase2 Caspase9 Caspase10 凋亡效應亞類Caspase蛋白酶 Caspase3 Caspase6 Caspase7 Caspase家族的特點以酶原的形式存在 需要活化 同源活化和異源活化 活化后形成四聚體的蛋白水解酶 發(fā)揮生物學作用C端同源區(qū)存在半光氨酸激活位點Caspase分 啟動酶和效應酶 Caspase活化機制 Caspase的活化是有順序的多步水解的過程 雖然分子各異 但是它們活化的過程相似 首先在caspase前體的N 端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N 端前肽 然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基 并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體 Caspase的效應機制 凋亡細胞的特征性表現 包括DNA裂解為200bp左右的片段 染色質濃縮 細胞膜活化 細胞皺縮 最后形成由細胞膜包裹的凋亡小體 然后 這些凋亡小體被其他細胞所吞噬 破壞細胞抗凋亡因素破壞細胞結構影響核酸的結構與功能 破壞細胞抗凋亡因素正?；罴毎蚝怂崦柑幱跓o活性狀態(tài) 這是由于核酸酶和抑制物結合在一起 如抑制物被破壞 核酸酶即可激活 引起DNA片段化 現知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶 因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶 caspase activateddeoxyribonuleaseCAD 而把它的抑制物稱為ICAD 有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成并顯示活性 因而ICAD對CAD的活化與抑制是必需要的 破壞細胞結構Caspase可直接破壞細胞結構 如裂解核纖層 核纖層 Lamin 是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體 由此形成核膜的骨架結構 使染色質 chromatin 得以形成并進行正常的排列 在細胞發(fā)生凋亡時 核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解 從而使核纖層蛋白崩解 導致細胞染色質的固縮 6影響核酸的結構與功能Caspase可作用于多種與DNA RNA功能有關的蛋白如滅活或下調與DNA修復有關的酶 mRNA剪切蛋白和DNA交聯蛋白 由于DNA的作用 這些蛋白功能被抑制 使細胞的增殖與復制受阻并發(fā)生凋亡 六 細胞凋亡的調節(jié) 1 Bcl 2家族 Bcelllymphoma leukemia 2 B細胞淋巴瘤 白血病 2 Bc1 2是一種原癌基因 是ced 9在哺乳類中的同源物 和一般的癌基因不同 Bc1 2延長細胞的生存 能抑制細胞凋亡 而不是促進細胞的增殖 Bcl 2家族已發(fā)現15個成員 所有Bcl 2家族成員均含有1個或多個BH結構域 蛋白含有4個Bcl 2同源結構域 依次命名為BHl BH2 BH3和BH4 可分為3個亞族 Bcl 2亞家族 Bcl 2Bcl xlBcl w Mcl 1 A1 Bcl 2亞家族成員對細胞凋亡起抑制作用Bax亞家族 Bax Bak Bok 它們的作用與Bcl 2亞家族的作用相反 可促進細胞凋亡 BH3亞家族 Bik Blk Hrk BNIP3 Biml Bad Bid 僅有BH3結構域 它們的作用也與Bcl 2亞家族的作用相反 可促進細胞凋亡 作用機制 影響APAF1的功能影響線粒體的結構與功能 2 VDAC和ANT是線粒體外膜上最為豐富的兩種蛋白 最近有一些研究工作表明 WDAC和ANT可與Bc1 2家族蛋白相互作用 在細胞凋亡過程中介導對線粒體的損傷 VDAC本身是一種通道蛋白 它與Bax的結合可使共通道性能發(fā)生某種變化 這樣一些凋亡蛋白如cytC就可通過 因為這兩種蛋白在跨越線粒體膜的核苷酸和小分子轉運中起作用 所以它們與Bax的結合可能與細胞凋亡過程中線粒體ATP ADP轉化和磷酸肌酸外運的抑制有關 3 P53與細胞凋亡P53是腫瘤抑制基因 其產物主要存在于細胞核內 P53基因是人類腫瘤有關基因中突變頻率最高的基因 在依賴P53蛋白的細胞凋亡中 P53基因是通過調節(jié)Bc1 2和Bax基因的表達來影響細胞凋亡的 P53蛋白能特異地抑制Bc1 2的表達 相反對Bax的表達則有明顯的促進作用 研究表明 P53蛋白是Bax基因的直接的轉錄活化因子 在這些細胞中 P53蛋白的積累和活動引起了細胞凋亡 4 IAP inhibitorofapoptosis 細胞凋亡抑制因子 IAP超家族的成員較多 如c IAP1 c IAP2 XIAP NIAP和Survivin 新的成員在不斷的被發(fā)現 IAP家族成員有一個共同的特征 含有一個或多個 個氨基酸的重復序列 BIR 類似于zinc指狀的結構 c IAP1 c IAP2和XIAP含有環(huán)指裝結構 BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導對caspase的抑制作用 而環(huán)指狀結構則具有泛素化蛋白連接酶的作用 介導caspase 和 的泛素化降解作用 5 Smac Dablo在細胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進入細胞質 成熟的Smac蛋白產生一個新的N基端 這個N基端的前面4個氨基酸可以與lAP的BIR結構域結合 Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結合 Smac與BIR2的結合可以中和XlAP對胱解酶9的抑制 促進凋亡 七 細胞凋亡的生物學意義 細胞凋亡與個體發(fā)育細胞凋亡與免疫細胞凋亡與人類疾病 免疫細胞凋亡 胸腺細胞成熟過程中的凋亡陽性選擇陰性選擇激活誘導的細胞凋亡 activation inducedcelldeath AICD CTL誘導靶細胞的凋亡 穿孔素介導的靶細胞死亡Fas介導的靶細胞凋亡B細胞凋亡 經過基因重排 92 的細胞凋亡 細胞凋亡與人類疾病 細胞凋亡受抑制有關的疾病惡性腫瘤 濾泡性淋巴瘤 乳腺癌 等白血病自身免疫性疾病 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 腎炎病毒感染性疾病 腺病毒病 庖疹病毒病細胞凋亡增多有關的疾病艾滋病 神經變性性疾病 早老性遲呆 帕金森病 小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病缺血性疾病酒精中毒性肝炎 八 細胞凋亡的檢測方法 一 細胞凋亡的形態(tài)學檢測 二 磷脂酰絲氨酸外翻分析 AnnexinV法 三 線粒體膜勢能 mt 的檢測四 DNA片斷化檢測五 TUNEL法六 Caspase 3活性的檢測七 WB檢測八 凋亡相關蛋白TFAR19的表達和細胞定位分析 細胞凋亡的形態(tài)學檢測 1光學顯微鏡和倒置顯微鏡未染色細胞 凋亡細胞的體積變小 變形 細胞膜完整但出現發(fā)泡現象 細胞凋亡晚期可見凋亡小體 染色細胞 常用姬姆薩染色 瑞氏染色 蘇木精染色等 凋亡細胞的染色質濃縮 邊緣化 呈新月狀附在核膜周圍 2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質的形態(tài)學改變來評判細胞凋亡的進展情況 常用的DNA特異性染料有 HO Hoechst33342 HO Hoechst33258 DAPI 3電子顯微鏡觀察 NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess 488nm 400 電鏡觀察凋亡細胞體積變小 細胞質濃縮 凋亡 期的細胞核內染色質高度盤繞 出現許多稱為氣穴現象的空泡結構 細胞凋亡的晚期 細胞核裂解為碎塊 產生凋亡小體 磷脂酰絲氨酸 PS 外翻分析 AnnexinV法 磷脂酰絲氨酸 Phosphatidylserine PS 正常位于細胞膜的內側 在凋亡早期 PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面 暴露在細胞外環(huán)境中 Annexin V是一種分子量為35 36KD的Ca2 依賴性磷脂結合蛋白 能與PS高親和力特異性結合 將Annexin V進行熒光素 FITC R PE 或biotin標記 以標記了的Annexin V作為熒光探針 利用流式細胞儀 熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生 AnnexinV FITCFluorescence PIFluorescence TimecourseofapoptosisinTF 1cellsculturedinGM CSF freemedium ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC AnnexinV PI 線粒體膜勢能 mt 的檢測 線粒體熒光染料 Rhodamine123 DiOC6 3 JC 1 TMRM等對線粒體膜電位非常敏感 其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低 DNA片段化分析 細胞凋亡時主要生物化學特征是其染色質發(fā)生濃縮 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂 形成180 200bp整數倍的寡核苷酸片段 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜 DNAladder 凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析TFAR19 PDCD5 是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自主知識產權的人類新基因 前期的功能研究表明 它是促進細胞凋亡的增強劑 利用熒光素 FITC 標記的TFAR19單克隆抗體為探針 對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現 凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象 伴隨著細胞核形態(tài)學的變化 持續(xù)較長時間 在凋亡小體中仍然可見 方法 ELISA Westernblot分析a TFAR19蛋白的細胞定位分析b TFAR19蛋白的表達與臨床疾病c 原發(fā)性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平 DoublestaininganalysisofnuclearlocalizationofTFAR19inK562andHeLacellstreatedwithVP16 170 m 思考題 免疫細胞凋亡的生理意義簡述細胞凋亡常用的檢測方法及原理簡述細胞凋亡的膜受體和線粒體途逕參考文獻 同學們 來學校和回家的路上要注意安全 同學們 來學校和回家的路上要注意安全