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1、課題課題3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離吳承恩中學高二生物組專題專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)2003年年4月月14日宣布人類基因組序列圖完成日宣布人類基因組序列圖完成這標志著進入了后基因組時代。這標志著進入了后基因組時代。人類基因組：指人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部分子所攜帶的全部遺傳信息。遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究 新華網(wǎng)首爾月日電（記者新華網(wǎng)首爾月日電（記者 干玉蘭）韓國浦項工干玉蘭）韓國浦項工業(yè)大學科學家日宣布，他們已查明可抑制艾滋病病毒感業(yè)大學
2、科學家日宣布，他們已查明可抑制艾滋病病毒感染的染的“”蛋白質(zhì)核心部分的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)核心部分的結(jié)構(gòu)。 浦項工業(yè)大學生物科學系教授吳秉夏等人，當天公開了浦項工業(yè)大學生物科學系教授吳秉夏等人，當天公開了“”蛋白質(zhì)內(nèi)核心部分蛋白質(zhì)內(nèi)核心部分“”的三維分子結(jié)構(gòu)，并稱已弄清楚這一結(jié)構(gòu)的正確位置及它與的三維分子結(jié)構(gòu)，并稱已弄清楚這一結(jié)構(gòu)的正確位置及它與其他結(jié)構(gòu)之間的相互作用。研究成果發(fā)表在最新一期其他結(jié)構(gòu)之間的相互作用。研究成果發(fā)表在最新一期分子分子細胞細胞雜志上。雜志上。 2年英國年英國自然自然雜志曾刊登論文說，雜志曾刊登論文說，“”蛋白質(zhì)可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各蛋白質(zhì)可有效抑制艾滋病病毒
3、的感染。此后，世界各地的很多科學家開始研究地的很多科學家開始研究“”蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但到目前為止尚未有人宣稱取得突破性進展。到目前為止尚未有人宣稱取得突破性進展。我國對蛋白質(zhì)的現(xiàn)階段研究 我國獨立主持國際我國獨立主持國際“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”，參，參加國際人類蛋白質(zhì)組研究計劃中的加國際人類蛋白質(zhì)組研究計劃中的“大規(guī)?？贵w制備大規(guī)?？贵w制備”項項目目 思考思考1 分離生物大分子的基本思路是什么？分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法分離具有選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。思考
4、思考2 蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。思考思考3 高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思考思考4 人們用雞的紅細胞提取人們用雞的紅細胞提取DNA，用人，用人
5、的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便，便于進行于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞的提取，人的紅細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。提取血紅蛋白。一、基礎知識：一、基礎知識： 凝膠色譜法（分配色譜法）：凝膠色譜法（分配色譜法）： 1、凝膠：、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）具多孔的凝膠就叫分子篩） 2、概念：、
6、概念：根據(jù)被根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行分離。膠的分子篩作用，來進行分離。3、原理：、原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對（對（ ）的蛋白質(zhì)容易進入）的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程（凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動速），移動速度（度（ ），而（），而（ ）的蛋白）的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（ ）移動，路程（）移動，路程（ ），移動速），移動速度（度（ ），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因），相對分子質(zhì)量不同的蛋白
7、質(zhì)因此得以分離。此得以分離。4、具體過程、具體過程相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較小較長較長較慢較慢相對分子質(zhì)量較大相對分子質(zhì)量較大凝膠外部凝膠外部較短較短較快較快凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。 緩沖溶液：緩沖溶液： 2、作用：、作用： 能夠抵制（能夠抵制（ ）的對溶液）的對溶液的（的（ ）的影響，維持）的
8、影響，維持PH基本不變?；静蛔?。外界的酸或堿外界的酸或堿PH值值 3、緩沖溶液的配制、緩沖溶液的配制 通常由（通常由（ ）種緩沖劑溶解于水）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ）就可以制得（就可以制得（ ）使用的）使用的緩沖液。緩沖液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范圍內(nèi)范圍內(nèi) 思考：說出人體血液中緩沖液。思考：說出人體血液中緩沖液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3電泳：電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。生遷移的過程。 在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖在血紅蛋白整個實驗室
9、中用的緩沖液是液是磷酸緩沖液磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的擬細胞內(nèi)的PHPH環(huán)境，保證血紅蛋白的正環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學研究（活性）料的科學研究（活性） 2、原理：許多重要的生物大分子，如、原理：許多重要的生物大分子，如（ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下下，這些基團會帶上，這些基團會帶上（ ） 。在電場的作用下，這些帶。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其（電分子會向著與其（ ） 移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身）以及分
10、子本身（ ）、（）、（ ）的）的不同使帶電分子不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（產(chǎn)生不同的（ ），從而實現(xiàn)樣），從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。品中各種分子的分離。多肽、核酸多肽、核酸可解離的基團可解離的基團正電或負電正電或負電所帶電荷相反的電極所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異帶電性質(zhì)的差異大小大小形狀形狀遷移速度遷移速度一定的一定的PH分類：分類：瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳和和聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠電泳。測定（測定（ ）通）通常用十二烷基硫酸鈉（常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠為了消
11、除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入中加入( )。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用的作用下會解聚成單條肽鏈，下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是因此測定的結(jié)果只是( )。SDS能與各種蛋白質(zhì)能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復合物，復合物，SDS所所帶帶負電荷負電荷的的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于遷移率完全取決于( )。 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率
12、取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS單條肽鏈的分子量單條肽鏈的分子量分子的大小分子的大小聚丙烯酰胺凝膠電泳對分離大分子具有聚丙烯酰胺凝膠電泳對分離大分子具有較高的分辨率，但核酸比蛋白質(zhì)分子大較高的分辨率，但核酸比蛋白質(zhì)分子大得多，只能采用較大孔徑的瓊脂糖凝膠得多，只能采用較大孔徑的瓊脂糖凝膠電泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，電泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸帶負電荷核酸帶負電荷，在電場中向正極移動。，在電場中向正極移動。溴化乙啶熒光染料對核酸染色在紫外線溴化乙啶熒光染料對核酸染色在紫外線的照射
13、下，發(fā)出橙紅色熒光。根據(jù)熒光的照射下，發(fā)出橙紅色熒光。根據(jù)熒光條帶的粗細和分布的位置，可以對其鑒條帶的粗細和分布的位置，可以對其鑒定。定。 說明：說明：電泳檢測結(jié)果電泳檢測結(jié)果（四）血紅蛋白（四）血紅蛋白 在紅細胞的組成中，約在紅細胞的組成中，約90%是血紅蛋白。它由是血紅蛋白。它由四四個肽鏈個肽鏈組成，包括兩個組成，包括兩個肽鏈和兩個肽鏈和兩個肽鏈。每條肽鏈。每條肽鏈環(huán)繞一個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素亞鐵血紅素基團，可攜帶基團，可攜帶一分子氧或一分子氧或一分子二氧化碳一分子二氧化碳。血紅蛋。血紅蛋白因含白因含血紅血紅素而呈現(xiàn)紅色。素而呈現(xiàn)紅色。二、實驗操作二、實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四
14、步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。鑒定。二二 實驗操作實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：1.樣品處理樣品處理血血液液血漿血漿水分水分固體物質(zhì)固體物質(zhì)血
15、漿蛋白血漿蛋白無機鹽無機鹽磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血細胞血細胞白細胞白細胞血小板血小板紅細胞紅細胞（最多）（最多）血紅血紅蛋白蛋白（ ）兩個兩個a a肽鏈肽鏈兩個兩個一肽鏈肽鏈樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定共四條肽鏈共四條肽鏈90（一）樣品處理（一）樣品處理 1、紅細胞的洗滌：、紅細胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。用生理鹽水洗滌。 2、血紅蛋白的釋放：、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放
16、在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放 3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。斗分出紅色透明液體。 4、透析：、透析： 裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為為7.0）透）透析。析。紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液有機溶劑有機溶劑 無色透明的甲苯層無色透明的甲苯層脂類物質(zhì)脂類物質(zhì) 白色脂溶性物質(zhì)沉淀白色脂溶性物質(zhì)沉淀層層血紅蛋白溶液血紅蛋白溶液 紅色透明液體紅色透明液體紅細胞破碎物沉淀紅細胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀暗紅色沉淀物物練習鞏固1
17、、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應用越來越深入，首先要白質(zhì)的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是做的一步是A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能弄清各種蛋白質(zhì)的功能C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D 獲得高純度的蛋白質(zhì)獲得高純度的蛋白質(zhì)2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是關于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B 相對分子質(zhì)量較小的
18、蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D 二者根本無法比較二者根本無法比較3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A 電荷的多少電荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽鏈的多少肽鏈的多少 D 分子形狀的差異分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH B 維持紅細胞的能量供應維持紅細胞的能量供應C 防止微生物生長防止微生物生長 D 防止血液凝固防止血液凝固5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的、一分子血紅蛋白最多可攜帶的 O2分子分子數(shù)和數(shù)和CO2分子數(shù)分別是分子數(shù)分別是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序分層順序自上而下自上而下是：是：有有機溶劑機溶劑-脂脂類物質(zhì)類物質(zhì)-血血紅蛋白溶液紅蛋白溶液-紅紅細胞破碎物沉淀細胞破碎物沉淀
課題3血紅蛋白的提取和分離
