《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)大綱

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1、《基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)B》教學(xué)大綱 課程編號(hào)：08207017 學(xué)時(shí)：51 學(xué)分：1.5 開課對(duì)象：生物科學(xué)專業(yè) 課程類別：專業(yè)必修 英文名稱：Basic Biology Experiments B 一、課程任務(wù)、目的 生物化學(xué)是四年制本科生物專業(yè)開設(shè)的一門專業(yè)基礎(chǔ)課，其中生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)課程通過生物化學(xué)分離、制備、分析、鑒定等實(shí)驗(yàn)（如滴定、比色、層析、電泳等），加強(qiáng)對(duì)學(xué)生基本技能的訓(xùn)練。同時(shí)要求學(xué)生了解掌握一些生化研究的理論和技術(shù)，為進(jìn)入生命科學(xué)各分支學(xué)科的研究鄰域打下基礎(chǔ)。 二、課程內(nèi)容與基本要求

2、實(shí)驗(yàn)一 甲醛滴定法測定氨基氮 一、目的要求： 初步掌握甲醛滴定法測定氨基酸含量的原理和操作要點(diǎn) 二、器材： 滴定管、吸量管、試管 三、內(nèi)容與方法： 1、滴定標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸，計(jì)算氨基氮回收率 2、滴定未知濃度甘氨酸，計(jì)算氨基氮 3、計(jì)算未知甘氨酸濃度 實(shí)驗(yàn)二 考馬斯亮藍(lán)染色法測蛋白質(zhì)含量 一、目的要求 學(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍(lán)G-250法測蛋白質(zhì)含量的原理和方法。 進(jìn)一步掌握721型分光光度計(jì)的使用方法和原理。 二、器材： 721型分光光度計(jì) 離心機(jī) 研缽 容量瓶 刻度吸管 試管 三、內(nèi)容與方法 1、 制備樣品溶液 2

3、、 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 3、 測定 實(shí)驗(yàn)三 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 一、目的要求： 學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理。 二、器材： 穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、水平電泳槽、醋酸纖維薄膜、鑷子、白瓷反應(yīng)板、大培養(yǎng)皿 三、內(nèi)容與方法： 1、浸泡薄膜 2、點(diǎn)樣 3、電泳 4、染色 5、漂洗 實(shí)驗(yàn)四 凱氏定氮法測定總氮量 一、目的要求： 學(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。 二、器材： 凱氏定氮儀、電爐、消化燒瓶、滴定管、吸量管 三、內(nèi)容與方法： 1、消化 2、蒸餾 3、滴定 實(shí)驗(yàn)五 Folin－酚法測蛋白質(zhì)濃度 一、目的要求： 掌握Folin－酚法

4、測蛋白質(zhì)濃度的原理和方法，學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。 二、器材： 試管、試管架、吸量管、恒溫水浴鍋、721分光光度計(jì) 三、內(nèi)容與方法： 1、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（蛋白質(zhì)濃度與反應(yīng)生成的藍(lán)色物質(zhì)的光吸收值的關(guān)系曲線） 2、未知濃度的蛋白與Folin－酚試劑反應(yīng)，測出蘭色物質(zhì)光吸收值 3、從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)蛋白濃度 實(shí)驗(yàn)六 苯丙氨酸聚氨酶（PAL）活力和比活力測定 一、目的要求 1、 學(xué)習(xí)一種常用的酶活力測定法，并與前面學(xué)過的二種酶活力測定法相比較； 2、 掌握苯丙氨酸解氨酶活力與比活力測定的原理與方法，為后面該酶分離純化的實(shí)驗(yàn)中測活力與比活力所需要； 3、 了解紫外分光光度計(jì)及

5、其使用。 二、器材： 電子天平 高速冷凍離心機(jī) 恒溫水浴 紫外分光光度計(jì) 721分光光度計(jì) 剪刀 研缽 試管 刻度小試管 塑料離心管 刻度吸管 燒杯 三、內(nèi)容與方法 1、提取酶液 2、酶活力測定 3、蛋白質(zhì)含量測定 4、計(jì)算 實(shí)驗(yàn)七 硫酸銨分級(jí)沉淀分離苯丙氨酸解氨酶 一、目的要求 了解硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的原理，掌握分級(jí)沉淀分離酶的基本操作和方法。 二、器材 天平 冷凍離心機(jī) 恒溫水浴 紫外分光光度計(jì) 鐘表 冰浴 試管 燒杯 玻棒 刻度吸管 研缽 剪刀 量筒 離心管 三、內(nèi)容與方法 1、酶

6、液提取 2、硫酸銨分級(jí)沉淀 3、沉淀樣品溶解 4、酶活力測定 實(shí)驗(yàn)八 凝膠層析純化苯丙氨酸解氨酶 一、目的要求 掌握葡聚糖凝膠柱層析法脫鹽的原理和基本操作方法，分離上一個(gè)實(shí)驗(yàn)所得沉淀液中的酶蛋白和硫酸銨。 二、器材 層析柱 紫外分光光度計(jì) 721分光光度計(jì) 恒溫水浴 鐘或手表 刻度吸管 刻度試管 試管 滴管 三、內(nèi)容與方法 1、層析脫鹽：凝膠溶脹，灌膠，層析，收集 2、酶活力測定 3、蛋白質(zhì)含量測定 實(shí)驗(yàn)九 過氧化物酶活力測定 一、目的要求： 了解酶活力、比活力概念，通過測定過氧化物酶活力，掌握酶活力測定的一般方法。 二、器材： 天平、

7、研缽、離心機(jī)、試管、量筒、恒溫水浴鍋、721分光光度計(jì) 三、內(nèi)容與方法： 1、酶液制備（植物樣品在酶抽提液中磨成勻漿，取清液） 2、酶活力測定（愈創(chuàng)木酚溶液中加入一定量酶液，再加入過氧化氫溶液，迅速混勻并測定） 實(shí)驗(yàn)十 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析過氧化物酶同工酶 一、目的要求 1、 學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理。 2、 學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。 二、器材 電泳儀一套（包括穩(wěn)壓電源及垂直電泳槽） 高速離心機(jī) 真空泵及抽濾器 烘箱（或培養(yǎng)箱） 細(xì)玻管及玻璃架 研缽 注射器 培養(yǎng)皿 燒杯 橡皮膏、剪刀等 三、內(nèi)容與方法 1、樣品制備 2、凝膠制備

8、 3、裝槽 4、點(diǎn)樣 5、電泳 6、取膠 7、染色 實(shí)驗(yàn)十一 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)影響 一、目的要求： 了解米氏常數(shù)意義，學(xué)習(xí)測定米氏常數(shù)的原理和方法。 二、器材： 錐形瓶、吸量管、滴定管、量筒 三、內(nèi)容與方法： 1、磷酸緩沖液配制（pH7.0 ,0.2M） 2、KMNO4 濃度標(biāo)定 3、H2 O2 濃度的標(biāo)定 4、H2 O2 酶制備 5、反應(yīng)速度測定 6、關(guān)系曲線制作 7、求出Km 實(shí)驗(yàn)十二 血清膽固醇的測定 一、目的要求： 了解掌握測定膽固醇的原理和方法 二、器材： 試管、試管架、容量瓶、吸量管、離心機(jī)、分光光度計(jì) 三、內(nèi)容與方法： 1

9、、血清經(jīng)無水乙醇處理，使蛋白沉淀 2、設(shè)置膽固醇標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管，分別與磷硫鐵試劑反應(yīng)，測定A560 3、計(jì)算血清蛋固醇含量 實(shí)驗(yàn)十三 還原糖和總糖的測定 一、目的要求： 了解3.5一二硝基水楊酸化色法測定糖原理，掌握還原糖及總糖定量測定的操作方法。 二、器材： 天平、燒杯、離心機(jī)、容量瓶、恒溫水浴鍋、白瓷板、分光光度計(jì) 三、內(nèi)容與方法： 1、面粉樣品中還原糖提取（水溶解法） 2、面粉樣品中總糖的提?。ǚ兴苤兴崴猓? 3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 4、樣品待測液的測定 5、標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)糖含量 實(shí)驗(yàn)十四、油料作物脂肪抽提和含量測定 一、目的要求 學(xué)習(xí)脂肪的提取

10、和測定方法 二、器材 索氏脂肪抽提器(一套)，分析天平，恒溫水浴鍋，烘箱，干燥器。 三、內(nèi)容與方法 1、樣品烘干、磨碎 2、濾紙包好樣品 3、抽提 4、烘干稱重 實(shí)驗(yàn)十五 水果中維生素Ｃ的測定 一、目的要求： 了解一種維生素Ｃ的測定方法和原理。 二、器材： 研缽、試管、離心機(jī)、721分光光度計(jì) 三、內(nèi)容與方法： 1、水果中維生素Ｃ提取 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品測定 實(shí)驗(yàn)十六 酵母RNA的提取及鑒定 一、目的要求 了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸組分的方法。 二、器材 1、乳缽 2、150ml錐形瓶 3、恒溫水浴箔 4、量簡 5、布氏漏斗及抽濾

11、瓶 6、吸管 7、滴管 8、試管及試管架 9、燒杯 10、離心機(jī) 11、漏斗 三、內(nèi)容與方法 1、RNA提取，干燥 2、嘌呤堿、核糖、磷酸等的鑒定 實(shí)驗(yàn)十七 定磷法測定核酸濃度 一、目的要求 掌握利用核酸定磷測定法測定核酸的含量。 二、器材 分析天平，722型分光光度計(jì)，恒溫水浴，200℃恒溫烘箱或萬用電爐，移液管，凱氏燒瓶4個(gè)，燒杯， 容量瓶，培養(yǎng)皿一個(gè)，稱量瓶一個(gè)，干燥器，試管20ml×20，離心管4個(gè)水浴鍋1個(gè)，藥勺1個(gè)。 三、內(nèi)容與方法 1、樣品的消化 2、用標(biāo)準(zhǔn)磷溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 3、總磷量的測定 4、無機(jī)磷測定 5、計(jì)算 實(shí)驗(yàn)十八

12、 脫氧核糖核酸的瓊脂糖凝膠電泳 一、目的要求 1、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法。 2、學(xué)習(xí)利用瓊脂糖膠電泳方法測定DNA片段大小。 3、 學(xué)習(xí)有關(guān)建立DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的基本技術(shù)。 二、器材 Eppendorf 離心管（1.5ml，經(jīng)消毒），電泳槽，電泳儀，凝膠塑料托盤 ，電泳樣品槽模板（梳子），錐形瓶（100ml）， 小燒杯（50，100，250ml），橡皮膏，電熱恒溫箱，玻璃紙。 三、內(nèi)容與方法 1、DNA的酶解 2、凝膠的制備 3、點(diǎn)樣 4、電泳 5、染色 6、觀察 實(shí)驗(yàn)十九 紙層析法分析生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨反應(yīng) 一、目的要求 1、掌

13、握紙層析法基本原理和操作方法。 2、利用紙層析法分離氨基酸，進(jìn)而了解生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用。 二、器材 （1） 研缽 （2） 試管及小離心管10ml*4 （3） 天平 （4） 刻度吸管 1ml*8 2ml*2 （5） 離心機(jī) （6） 恒溫水?。?70C） （7） 沸水浴 （8） 層析紙、鉛筆、小尺 （9） 毛細(xì)管 （10） 電吹風(fēng)機(jī) （11） 訂書機(jī) （12） 層析缸、培養(yǎng)皿 （13） 噴霧器 三、內(nèi)容與方法 1、酶液的制備 2、轉(zhuǎn)氨反應(yīng) 3、裁紙 4、點(diǎn)樣 5、擴(kuò)展 6、顯色 7、計(jì)算 三、課程難點(diǎn)與重點(diǎn) 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較為復(fù)

14、雜，操作要求高，所需時(shí)間長，應(yīng)成分調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性。 四、實(shí)踐環(huán)節(jié)及基本要求 各實(shí)驗(yàn)盡量采用學(xué)生較為熟悉的材料，用生產(chǎn)實(shí)踐和各研究領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)。 五、對(duì)學(xué)生能力培養(yǎng)的要求 通過生物化學(xué)分離、制備、分析、鑒定等實(shí)驗(yàn)（如滴定、比色、層析、電泳等），加強(qiáng)對(duì)學(xué)生基本技能的訓(xùn)練，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)造性思維能力。 了解掌握一些生化研究的理論和技術(shù)，為進(jìn)入生命科學(xué)各分支學(xué)科的研究鄰域打下基礎(chǔ)。 六、學(xué)時(shí)分配（總學(xué)時(shí)數(shù)為51，包括實(shí)驗(yàn)理論部分、6個(gè)必做實(shí)驗(yàn)和3~4個(gè)選做實(shí)驗(yàn)） 1、實(shí)驗(yàn)理論部分（總14學(xué)時(shí)），包括： 電泳技術(shù)（5學(xué)時(shí)），層析技術(shù)（4學(xué)時(shí)），核酸研究方法（5學(xué)時(shí)）。 2、必

15、做實(shí)驗(yàn)（總學(xué)時(shí)為25） 序號(hào) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 學(xué)時(shí)數(shù) 1 Folin－酚法測蛋白質(zhì)濃度 3 2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活力和比活力測定 4 3 過氧化物酶活力測定 4 4 過氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳 8 5 面粉中還原糖和總糖的測定 3 6 酵母核糖核酸的提取和組分鑒定 3 3、選做實(shí)驗(yàn)（選做下列實(shí)驗(yàn)中的3~4個(gè)，完成12學(xué)時(shí)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容） 序號(hào) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 學(xué)時(shí)數(shù) 1 甲醛滴定法測定氨基氮 3 2 考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)含量 3 3 硫酸銨分級(jí)沉淀分離苯丙氨酸解氨酶 6 4 凝膠層析法純化苯丙氨酸解氨酶 6 5

16、 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 6 6 血清膽固醇的測定 3 7 粗脂肪的提取和定量測定 3 8 水果（蔬菜）中Vc含量的測定 3 9 紙層析法分析氨基酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng) 4 10 脫氧核糖核酸的瓊脂糖凝膠電泳 3 11 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 3 12 凱氏定氮法測定總氮量 8 13 定磷法測定核糖核酸純度 6 七、考核方式 由平時(shí)成績和期末考查成績兩部分組成，以平時(shí)成績?yōu)橹鳌? 八、教材和參考書 1、基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，北京師范大學(xué)生物系編，高等教育出版社，1982。 2、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法，李建武等編，北京大學(xué)出版社，1994。 3、自編材料。