糧食中玉米赤霉烯酮膠體金快速測試卡檢測方法編制說明

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1、 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測試卡檢測方法》 編制說明 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測試卡檢測方法》 標(biāo)準(zhǔn)起草組 2011年11月 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測試卡檢測方法》 編制說明 1．任務(wù)來源及工作過程 國務(wù)院糧食管理流通條例和糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)都明確規(guī)定糧食收購要對真菌毒素玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢驗控制，而我國標(biāo)準(zhǔn)體系中缺少嘔吐毒素快速檢測的方法及標(biāo)準(zhǔn)因此，該項研究迫在眉睫。 我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛，糧食收購多集中在縣以下單位的糧食收儲庫點。時間短，收購量大，存在很多隱患

2、。主要集中在以下方面：一方面糧食入庫時間短，不宜長時間露天存放，因此對玉米赤霉烯酮的檢測需要快速定性。另一方面收購企業(yè)技術(shù)力量和硬件設(shè)備不足，利用大型儀器檢測收購糧真菌毒素?zé)o法普及。因此目前在糧食收購環(huán)節(jié)最需要解的問題就是建立高效、快速、低成本的定性檢測方法。 傳統(tǒng)上，真菌毒素的分析一般采用薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。TLC雖然簡便，但靈敏度差；HPLC雖然靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操作復(fù)雜，儀器昂貴。這兩種方法都不適合在收購原糧時進(jìn)行快速定性檢測。因此需要玉米赤霉烯酮快速檢測方法的研究，從源頭解決儲備糧真菌毒素污染問題。 為了確保公民的飲食安全，進(jìn)一步保證產(chǎn)品質(zhì)量、

3、規(guī)范生產(chǎn)、為市場監(jiān)督提供依據(jù)，需要制定《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測試卡檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)，按照GB2760-2007的要求，對小麥粉及其制品中玉米赤霉烯酮的含量進(jìn)行監(jiān)督。 本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定是根據(jù)國家糧食局標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量中心下達(dá)的 年國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂任務(wù)，由北京市糧油食品檢驗所負(fù)責(zé)起草。項目編號： 2. 編制過程 2.1 第一階段工作 第一階段為收集國內(nèi)外玉米赤霉烯酮測試分析標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)資料，了解掌握玉米赤霉烯酮測定方法的最新技術(shù)發(fā)展情況階段。本階段查閱了大量的文獻(xiàn)資料，參考國內(nèi)外玉米赤霉烯酮測定方法的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)編制小組成員經(jīng)過研究和討論一致認(rèn)為，膠體金快速

4、檢測方法具有較好的可操作性和實用性，因此我們參考這些先進(jìn)方法和產(chǎn)品，并根據(jù)國內(nèi)糧食行業(yè)的實際生產(chǎn)和檢測技術(shù)應(yīng)用情況，著手制定《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測試卡檢測方法》的基本思路和主要工作方向。 2.2 第二階段工作 第二階段為組織起草并召開標(biāo)準(zhǔn)起草組工作會議。本標(biāo)準(zhǔn)起草組在經(jīng)過收集、整理資料和調(diào)研工作的基礎(chǔ)上，提出標(biāo)準(zhǔn)提綱，確定了標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容和要求。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組成員單位進(jìn)行討論、論證，形成標(biāo)準(zhǔn)初步文本；標(biāo)準(zhǔn)起草組成員單位間通過多種形式不斷交流、補(bǔ)充、完善標(biāo)準(zhǔn)文本，進(jìn)行驗證試驗和比對試驗，最終形成該標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。 本階段重點組織了玉米赤霉烯酮檢測方法的驗證試驗。先后開展了兩

5、輪比對試驗，針對各家分析實際操作時標(biāo)準(zhǔn)文本中存在的問題及建議，對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修改，得到標(biāo)準(zhǔn)起草小組的一致認(rèn)可，形成該標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。 3 編制原則 3.1 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009、GB/T 20000.2-2009 和GB/T 20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4 部分 化學(xué)分析方法》的規(guī)定和要求編寫，在標(biāo)準(zhǔn)框架、結(jié)構(gòu)和內(nèi)容等方面符合這些標(biāo)準(zhǔn)的要求。 3.2 強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了糧食中玉米赤霉烯酮的安全限量，且本標(biāo)準(zhǔn)所確定的檢測方法能滿足該標(biāo)準(zhǔn)的初步篩選測定。 4.國家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù) 4.1 本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快

6、速測試卡檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)為推薦性標(biāo)準(zhǔn)，其主要內(nèi)容包括： （1） 封面 （2） 前言 （3） 標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器設(shè)備、樣品制備、樣品測定與結(jié)果判定。 4.2 主要試驗（或驗證）的分析 4.2.1標(biāo)準(zhǔn)方法原理 玉米赤霉烯酮毒素膠體金快速測試卡檢測技術(shù)原理是基于抗原抗體反應(yīng)、免疫金標(biāo)記技術(shù)及毛細(xì)管層析技術(shù)。以微孔膜為固相載體，將可特異性識別玉米赤霉烯酮的抗體標(biāo)記紅色或紫紅色的膠體金顆粒，檢測卡的膜上兩個色帶分別固定玉米赤霉烯酮抗原，以及抗鼠源性抗體的二抗，根據(jù)色帶的顏色變化進(jìn)行結(jié)果評估。質(zhì)控色帶（control line）不會被樣品中的玉米赤霉烯酮影響，而

7、在每次反應(yīng)后都應(yīng)出現(xiàn)，用于證明檢測條是否正常。檢測色帶（test line）在樣品中沒有玉米赤霉烯酮或樣品中玉米赤霉烯酮的含量低于檢測限時會顯現(xiàn)；在樣品中玉米赤霉烯酮含量等于或高于檢測限時不出現(xiàn)。 4.2.2驗證方案 4.2.2.1驗證對象及驗證單位 參考糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，確定本次驗證糧種為小麥和玉米，考慮到加標(biāo)樣品的毒素分布、均勻性等影響，本次驗證全部采用天然陽性樣品進(jìn)行驗證；驗證毒素為玉米赤霉烯酮（DON）；驗證用膠體金快速測試卡采用國內(nèi)二家公司提供的DON三批次。驗證單位為（北京）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心、（湖北）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心、（遼寧）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心、（重慶）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測

8、中心、（四川）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心和（廣西）國家糧食質(zhì)量監(jiān)測中心。 4.2.2.2陽性樣品的制備 北京中心將收集到的陽性樣品粉碎，至少80%以上通過20目篩，篩上和篩下物混勻，采用免疫親和柱高效液相色譜法對制備的陽性樣品進(jìn)行混合均勻度測定，混合均勻性達(dá)到要求后將陽性樣品分發(fā)給六家國家檢測中心。 4.2.2.3 陽性樣品定值 六家國家檢測中心收到陽性樣品后，采用免疫親和柱高效液相色譜法進(jìn)行平行試驗測定結(jié)果報送北京中心進(jìn)行統(tǒng)計處理，取平均值作為理論值。 4.2.2.4 測試卡驗證 六家國家中心將分發(fā)并定值后的高濃度陽性樣品與空白樣品按照各測試卡樣品量要求分別稱取，配置所需濃度，然后按照

9、測試卡說明書指定的方法進(jìn)行測定。 4.2.3結(jié)果與分析 采用兩種DON測試卡（測試卡A和測試卡B），各三個批次，按照各自規(guī)定的操作步驟和評定方法對玉米中DON進(jìn)行了測定。 4.2.3.1 準(zhǔn)確性 4.2.3.1.1測試卡A 根據(jù)結(jié)果，共進(jìn)行21個濃度150次有效測試，共出現(xiàn)誤判21次，判定準(zhǔn)確率為86%，假陽誤判出現(xiàn)3次，假陰誤判出現(xiàn)18次。 具體結(jié)果見下表1： 表1玉米赤霉烯酮測試卡A誤判情況表 品種 測試次數(shù) 誤判 次數(shù) 誤判率 % 假陰誤判次數(shù) 假陰誤判率% 假陽誤判次數(shù) 假陽誤判率% 玉米 150 21 14.0 18 12.0 3 2

10、.0 4.2.3.1.2測試卡B 根據(jù)結(jié)果，共進(jìn)行21個濃度142次有效測試，共出現(xiàn)誤判24次，判定準(zhǔn)確率為83.1%，假陽誤判出現(xiàn)9次，假陰誤判出現(xiàn)15次。 具體結(jié)果見下表2： 表2玉米赤霉烯酮測試卡B誤判情況表 品種 測試次數(shù) 誤判 次數(shù) 誤判率 % 假陰誤判次數(shù) 假陰誤判率% 假陽誤判次數(shù) 假陽誤判率% 玉米 142 24 16.9 15 10.6 9 6.3 4.2.3.2重復(fù)性 測試卡A：按照驗證方案，共進(jìn)行240次測試，其中有效結(jié)果為240次，共出現(xiàn)誤判29次，判定準(zhǔn)確率為87.9%，其中假陰性誤判次數(shù)為11次，出現(xiàn)比例為4.6%。

11、 測試卡B：按照驗證方案，共進(jìn)行243次測試，其中有效結(jié)果為243次，共出現(xiàn)誤判29次，判定準(zhǔn)確率為88.1%，其中假陰性誤判次數(shù)為20次，出現(xiàn)比例為8.2%。 4.2.3.3穩(wěn)定性 4.2.3.3.1 測試卡A 根據(jù)有效結(jié)果，按照含量為限量標(biāo)準(zhǔn)時應(yīng)判定為陽性的規(guī)則，各不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果如下表3： 表3測試卡A不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果 批次 測試次數(shù) 誤判 判定準(zhǔn)確率% 20101110 16 1 93.8 20101116 25 2 92.0 20101126 24 3 87.5 20101106 15 2 86.7 批間相對偏差% 3.8

12、 4.2.3.3.2測試卡B 根據(jù)有效結(jié)果，按照含量為限量標(biāo)準(zhǔn)時應(yīng)判定為陽性的規(guī)則，各不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果如下表4： 表4測試卡B不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果 批次 測試次數(shù) 誤判 判定準(zhǔn)確率% G101009301 33 0 100 G101125304 39 0 100 G101125305 29 5 82.8 批間相對偏差% 10.5 4.2.3.4 約定誤差范圍試驗 測試卡A：在40-80ppb濃度范圍內(nèi)，對玉米樣本共進(jìn)行12個濃度的測定，共獲得有效結(jié)果102次，假陰出現(xiàn)16次，基本平均分布在60-80ppb濃度之間，且110與120ppb濃度下

13、也各出現(xiàn)1次誤判；假陽出現(xiàn)3次，分別在在55ppb濃度2次、58ppb濃度1次，總體樣本假陽誤判率為2.9%。 測試卡B：在40-80ppb濃度范圍內(nèi)，對玉米樣本共進(jìn)行12個濃度的測定，共獲得有效結(jié)果92次，假陰出現(xiàn)14次，基本平均分布在60-80ppb濃度之間，另外，在120ppb濃度下出現(xiàn)1次誤判；假陽出現(xiàn)9次，分別在在40ppb-58ppb濃度之間，總體樣本假陽誤判率為9.8%。 4.2.4結(jié)論 4.2.4.1現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的ZEN測定方法精密度（見表5）。 表5玉米赤霉烯酮檢測相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)號 GB/T5009.209-2008 GB/T 23504-2009

14、 SN/T 1772-2006 標(biāo)準(zhǔn)名稱 食品中玉米赤霉烯酮的測定 進(jìn)出口糧谷中玉米赤霉烯酮的測定 采用方法 免疫親和層析HPLC 薄層色譜 ELISA HPLC 重復(fù)性% 15 10 10 15 / 再現(xiàn)性% / / / / / 檢出限/量 5ug/kg 20ug/kg 20ng 0.25ng 5ug/kg 回收率% / 70-100 / / 73.7-98.2 4.2.4.2測試卡性能（見表6）： 表6測試卡B不同產(chǎn)品批次測定結(jié)果準(zhǔn)確率 批次 測試卡A % 測試卡B % 備注 準(zhǔn)確性 86 8

15、3.1 玉米 重復(fù)性 87.9 88.1 玉米 穩(wěn)定性 90 95.0 玉米 約定誤差范圍（50 mg/kg~70 mg/kg） 81.2 73.3 玉米 4.2.4.3 嘔吐毒素測試卡指標(biāo)設(shè)定 準(zhǔn)確性判定誤判率：結(jié)合4.2.4.1中目前國內(nèi)方法的各項指標(biāo)可設(shè)定為小于15% 重復(fù)性判定誤判率：結(jié)合4.2.4.1中目前國內(nèi)方法的各項指標(biāo)可設(shè)定為小于15% 穩(wěn)定性判定誤判率：結(jié)合4.2.4.1中目前國內(nèi)方法的各項指標(biāo)可設(shè)定為小于15% 約定誤差范圍（50 mg/kg~70 mg/kg）內(nèi)判斷誤判率： 該方法中，兩種測試卡的約定誤差范圍誤判率提取機(jī)制上進(jìn)一步改進(jìn)

16、，應(yīng)當(dāng)能解決誤判率告的問題，因此將該濃度范圍內(nèi)的誤判率定為小于15% 5.國家標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)或推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)的建議 建議將此國家標(biāo)準(zhǔn)列為推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)。 6.貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過度辦法等內(nèi)容） 建議職能管理機(jī)構(gòu)，指定生產(chǎn)部門，生產(chǎn)貫徹本標(biāo)準(zhǔn)以達(dá)到保護(hù)消費者權(quán)益的目的。 7.新舊國家標(biāo)準(zhǔn)的總體對比 8.技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證及預(yù)期的社會經(jīng)濟(jì)效果 國際上少數(shù)國家針對糧食玉米赤霉烯酮含量的檢測制定了試行方法，但方法均不統(tǒng)一。我國目前還未制定相關(guān)的快速篩選方法標(biāo)準(zhǔn)。隨著食品安全、糧食安全戰(zhàn)略意義的不斷擴(kuò)大，以及我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，加入世界貿(mào)易組織，與

17、國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，必須制定相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行安全控制?，F(xiàn)狀：我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛，糧食收購多集中在縣以下單位的糧食收儲庫點。時間短，收購量大，存在很多隱患。主要集中在以下方面：一方面糧食入庫時間短，不宜長時間露天存放，因此對玉米赤霉烯酮的檢測需要快速定性。另一方面收購企業(yè)技術(shù)力量和硬件設(shè)備不足，利用大型儀器檢測收購糧真菌毒素?zé)o法普及。因此目前在糧食收購環(huán)節(jié)最需要解的問題就是建立高效、快速、低成本的定性檢測方法。 該標(biāo)準(zhǔn)的制定有利于促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的調(diào)整、推動技術(shù)進(jìn)步和技術(shù)創(chuàng)新、推進(jìn)與國際慣例接軌；有利于糧食質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的建立；有利于公共食品安全。 9.參考的國際標(biāo)準(zhǔn)

18、 無 10.與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 11.關(guān)于強(qiáng)制性條款 12.貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議 1）首先應(yīng)在實施前保證文本的充足供應(yīng)，讓每個使用者都能及時得到文本。這是保證新標(biāo)準(zhǔn)貫徹實施的基礎(chǔ)。 2）發(fā)布后、實施前應(yīng)將信息在媒體上廣為宣傳。 3）本次修訂，不僅與生產(chǎn)廠家有關(guān)，而且與消費者有關(guān)。對于使用過程中容易出現(xiàn)的疑問，要在媒體上撰文事先予以解釋。 4）要分別標(biāo)準(zhǔn)的不同使用對象，消費者、生產(chǎn)廠家、質(zhì)量監(jiān)管部門等，有側(cè)重點地進(jìn)行培訓(xùn)、宣傳。 5）實施的過渡期宜定為6個月。 6）建議質(zhì)量監(jiān)督部門加強(qiáng)監(jiān)測。 13.廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議 無