《動物細(xì)胞培養(yǎng)》實驗內(nèi)容(共10頁)

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1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上 《細(xì)胞工程實驗技術(shù)》 （動物細(xì)胞培養(yǎng)部分） 目 錄 實驗一 實驗器材的清洗、包裝和消毒 一、實驗?zāi)康? 1、 掌握細(xì)胞培養(yǎng)常用實驗器材的清洗要領(lǐng)、清洗步驟和注意事項。 2、 掌握細(xì)胞培養(yǎng)常用器材的包裝要領(lǐng)和要求。 3、 掌握正壓濾器的安裝、使用和拆除方法及操作注意事項。 二、實驗用品 以組為單位包裝物品 1、 量筒（100mL、500mL） 2、 大、小燒杯3個 3、 1000mL容量瓶×1 4、 移液管1mL×3(滅菌) 5、 （10

2、0mL、250mL、500mL）鹽水瓶、（500mL）廣口瓶×各4(滅菌) 6、 眼科剪刀、眼科鑷子各2把(滅菌) 7、 細(xì)胞培養(yǎng)瓶×3(滅菌) 其它：飯盒、青霉素瓶、牛皮紙、離心管、滴管、注射器、磁棒、繩、標(biāo)簽紙等雜干。 三、實驗內(nèi)容 （一） 清洗 1、 要領(lǐng)：浸泡、刷洗、酸泡。 2、 步驟：洗衣粉浸泡12h→刷洗→流水震蕩沖洗15~20遍→漓水→蒸餾水洗蕩2次→37℃烘干→待包裝。 3、 注意事項： (1) 使用后的器材要立即投入水中。 (2) 器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。 (3) 器材要用流水震蕩干凈。 （二） 包裝 1、 大的器材如：量筒

3、、廣口瓶、培養(yǎng)皿、吸管等要包裝。 2、 小的器材如：注射器、剪刀、鑷子放入飯盒。 3、 注意事項： (1) 包裝時手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材使用端。 (2) 封閉器材使用端，標(biāo)記器材手持端。 (3) 小包裝 (4) 玻璃管道口加棉花。 （三） 濕熱消毒：高壓滅菌鍋消毒 四、作業(yè) 1、 清洗的要求為何較高？你認(rèn)為該如何保證器皿中無雜質(zhì)？ 2、 器材包裝有何要求？ 3、 實驗二 常用的儀器設(shè)備介紹 一、實驗?zāi)康? 了解動物細(xì)胞培養(yǎng)中常用儀器設(shè)備的使用方法、注意事項和保養(yǎng)方法 二、實驗用品 1） 超凈工作臺 2） 自動雙重純水蒸餾器 3） 高壓蒸氣滅

4、菌器 4） 過濾器 5） 電熱恒溫干燥箱 6） 二氧化碳培養(yǎng)箱 7） 冰箱 8） 倒置顯微鏡 三、實驗內(nèi)容 1、 了解超凈工作臺的工作原理 2、 自動雙重純水蒸餾器結(jié)構(gòu)、使用注意事項。 3、 高壓蒸氣滅菌器的工作原理 4、 正壓過濾器的使用方法 5、 二氧化碳培養(yǎng)箱的使用方法 四、作業(yè) 1、敘述超凈工作臺的工作原理 2、正壓過濾器為何會除菌 實驗三 常用動物細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制 一、實驗?zāi)康? 掌握常用動物細(xì)胞培養(yǎng)用液的組成及配制方法。 二、實驗用品與儀器 量筒、燒杯、廣口瓶、天平、各種無機(jī)

5、鹽、 三、實驗內(nèi)容 （一）平衡鹽溶液的配制 1、平衡鹽溶液的配方如下： NaCl KCl CaCl2 MgSO4·7H2O Na2HPO4·2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 苯酚紅 Hanks 8.00 0.40 0.14 0.20 0.06 0.06 0.35 1.00 0.02 D-Hanks 8.00 0.40 0.06 0.06 0.35 0.02 I組配Hanks（1000mL），V組配D-Hanks（1000mL），其他各組不配平衡鹽溶液。 2、配制方法：（以Hanks液為

6、例） (1) 甲液：用約100mL蒸餾水溶解CaCl2， (2) 乙液：用約750mL蒸餾水溶解Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、NaCl、KCl。 (3) 將甲液徐徐加入乙液中。 (4) 將0.35gNaHCO4溶解在100mL蒸餾水中 (5) 用數(shù)滴NaHCO4液溶解0.02克酚紅。 (6) 將4、5液移入3液中。 (7) 用雙蒸水定容至1000mL，充分混勻，調(diào)節(jié)PH為7.4。4℃冰箱過夜。 (8) 濾過消毒，小瓶分裝（500mL、250mL×2），冷藏。 3、配制要求 (1) 配制后液體呈桃紅色，PH

7、7.4左右，沒有混濁和沉淀。 (2) 含Ca、Mg的物質(zhì)要單獨溶解。 (3) 用于分離細(xì)胞的消化液宜用無Ca、Mg離子的D-Hanks液或PBS液配制。 （二）200mmol/l，L-谷氨酰胺（10mL）(II組配) 方法：稱取0.292g（M146.12）+雙蒸水10mL→濾過除菌→-20℃保存。 使用：每100mL培養(yǎng)基加1mL L-谷氨酰胺。 （三）抗菌素液（青霉素、鏈霉素）(III組配) 1、方法：10mL Hangks液或雙蒸水溶解100萬鏈霉素，再用8mL鏈霉素溶解80萬u的青霉素，成每毫升青霉素、鏈霉素各10萬單位的母液。 2、使用：100mL培養(yǎng)液加青、鏈霉素母

8、液0.1mL。 （四）RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配制(IV組配) 甲液：RPMI-1640 10.4g Hepes 2.7g 雙蒸水 700mL 攪拌至顆粒完全溶解（橙紅色） 乙液：NaHCO3 2.2g 雙蒸水 30mL 30min 顆粒完全溶解 將甲、乙兩液混合，加水至終1000mL定容，4℃冰箱靜止2~3h，濾過除菌，分裝（250mL、250mL、500mL）無菌試驗，寫好組號，-20℃保存。 注意：用三天內(nèi)制備的蒸餾水配制，培養(yǎng)基各成分是否完全

9、溶解的判斷方法：將培養(yǎng)液置室溫或4℃冰箱靜止30min，觀察瓶底有無顆粒產(chǎn)生。 （五）5.6 %NaHCO4液（100mL）(V 組配) 方法：用雙蒸水100mL配制，濾過除菌，分裝于廣口瓶，4℃冰箱保存，使用時，NaHCO4液要逐滴加入，并不時攪動培養(yǎng)液，以防PH過高。 （六）0.25%胰蛋白酶溶液（400mL）(VI組配)     1：250的胰蛋白酶(Trypsin)粉               &#

10、160; 1.0g     D-Hanks                       400mL 先用少量D-Hanks溶解胰蛋白酶，再將剩下的液體加入混合，置37℃水浴中1h左右(待徹底溶解，液體呈透明為止)，用5.6％NaHCO4調(diào)整pH至7.6～7.8，用0.22微型濾膜抽濾，分裝置4℃冰箱中保存。 （七）0.02

11、%EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）溶液（200mL）(VI組配) 方法：稱取EDTA 4g + 200mL D-Hanks液 → 0.02%，濾過除菌，備用。 四、思考題： 1、配制后液體呈黃色意味著液體的PH發(fā)生了什么變化？ 2、用于分離細(xì)胞的消化液為什么宜用無Ca、Mg離子的D-Hanks液或PBS液配制 3、L-谷氨酰胺在營養(yǎng)液中有何作用？ 4、營養(yǎng)液制備后為什么要小劑量分裝？ 實驗四 組織塊原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及生物學(xué)檢測 一、實驗?zāi)康? 掌握組織塊原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)的基本方法和操作特點及生物學(xué)檢測的

12、基本方法和操作要點。 二、實驗器材與用品 1、肝組織 2、平衡鹽（BSS）液（各組自己配的）×100mL 3、細(xì)胞培養(yǎng)皿 4、完全培養(yǎng)液 5、滅菌培養(yǎng)皿×1個/人 6、眼科剪、鑷子、吸管等 7、0.4% 臺盼藍(lán) 8、血球計數(shù)板和蓋玻片 三、實驗步驟 （一）組織塊原代培養(yǎng) 1、將一小塊肝組織置于滅菌培養(yǎng)皿中，用Hanks或D-Hanks液漂洗表面，吸凈Hanks或D-Hanks，用眼科剪反復(fù)剪成1~2mm3大?。s需20~30min）。 2、吸管吸取1~2mL Hanks或D-Hanks液吹下剪刀中的碎塊，然后，反復(fù)吹打，靜置片刻

13、，吸除上清BSS。 3、用吸管吸取小塊肝組織于培養(yǎng)瓶底部，均勻，間距離0.5cm為宜，加少量培養(yǎng)液（維持濕潤即可）。 4、次日，組織貼壁后，再補(bǔ)加營養(yǎng)液。 5、37℃溫箱培養(yǎng)，24~48后觀察。 （二）組織塊傳代培養(yǎng) 1、將長成單層的原代培養(yǎng)組織塊從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液――0.25%胰蛋白酶溶液。（以液面蓋住細(xì)胞為宜），靜置5～10分鐘。 2、在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變園，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈工作臺中將消化液倒掉，加入3～5mL新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液。 3、將細(xì)胞懸液吸出2mL左右，加到另一個培

14、養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3mL左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。 （三）組織培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查 1、營養(yǎng)液PH值的檢查 (1) 新鮮的培養(yǎng)液呈橙紅色。 (2) 細(xì)胞生長旺盛，代謝酸性產(chǎn)物增多，營養(yǎng)液酸性變黃。 (3) 培養(yǎng)瓶若刷洗不潔，殘留堿性物質(zhì)，致營養(yǎng)液PH增高，呈紫紅色。一般情況下，每周換液2次，每次換半量或1/3量。 2、微生物的污染與排除 （1）細(xì)菌污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染物的檢測 污染的細(xì)菌量比較大，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點

15、狀的細(xì)菌顆粒。原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預(yù)防細(xì)菌污染有效。 （2）真菌污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測 大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯穿行于細(xì)胞之間。 （3）支原體污染對細(xì)胞影響及污染物的檢測 支原體污染后，因為它們不會使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細(xì)胞受到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長等。 四、思考題 1、你認(rèn)為該如何操作才能保證培養(yǎng)過程中無微生物

16、污染？ 2、你認(rèn)為組織塊培養(yǎng)成功需哪些條件？ 3、原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)有哪些區(qū)別? 實驗五 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查 一、實驗?zāi)康? 掌握心肌細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法和操作特點，為傳代培養(yǎng)作好準(zhǔn)備。 二、實驗器材與用品 1、鵪鶉的心臟 2、平衡鹽（BSS）液（各組自己配的）×100mL 3、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（每人一個） 4、完全培養(yǎng)液 5、滅菌培養(yǎng)皿×1個/人 6、眼科剪、鑷子、吸管等

17、 7、0.25%胰蛋白酶液 8、0.02%EDTA液 9、無菌離心管 10、100目銅篩 三、實驗內(nèi)容 （一）原代培養(yǎng)實驗步驟 1、取材 (1) 取一只鵪鶉，斷頸處死，用75%酒精浸泡消毒。 (2) （在超凈工作臺中操作）剪開胸壁，取出心臟，放入Hanks或D-Hanks液中。 (3) 用Hanks或D-Hanks液沖洗心臟后，剪去心房，取心室肌，然后，用Hanks或D-Hanks液沖洗3次。 2、漂洗與剪切 (1) 將心室肌置于無菌培養(yǎng)皿中，剪成10塊左右的小塊，用Hanks或D-Hanks清洗2次，吸去多余的液體。 (2) 用眼科剪反復(fù)剪切

18、成1 mm3左右大小，約需20~30min。 3、消化 (1) 無菌培養(yǎng)皿中的小組織塊用Hanks或D-Hanks液沖洗，移入離心管中（蓋好蓋子，請注意無菌操作），低速離心（500~800r/min）×7min。 (2) 用吸管去除上清液，加入沉淀量5~8倍的0.25%胰蛋白酶液，37℃水浴搖晃20min，用吸管吹打組織塊，以分離細(xì)胞，然后，加入完全培養(yǎng)液約5mL，終止消化。 4、制備單細(xì)胞懸液 (1) 將上述懸液500~800r/min×7min，吸除上清液。 (2) 用BSS液漂吸2~3min（用吸管反復(fù)輕打松散組織），離心去上清液，共兩次。 (3) 去上

19、清液后加15mL細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻計數(shù)約5×105個/mL。 5、接種 (1) 25mL培養(yǎng)瓶中先加入1.5mL培養(yǎng)液，再接種1mL細(xì)胞懸液。 (2) 持瓶左右、上下輕輕搖晃，移入37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每隔2~3天換液1次。 （二）傳代培養(yǎng)實驗步驟 1、取原代培養(yǎng)物，吸除原瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞振入培養(yǎng)液內(nèi)，將懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞移入離心管中。 2、消化 （1）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶（0.5mL）和EDTA液（0.5mL）約5~8min，需終止消化（加基礎(chǔ)培養(yǎng)液1mL）。 （2）收集消化下來的細(xì)胞，歸入前離心管中，500~800r/m

20、in×5min，去除上清液。 3、分瓶培養(yǎng)：沉淀物加少量完全培養(yǎng)液，搖勻，分別接種到兩個新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶再補(bǔ)加2.0mL培養(yǎng)液，十字形混勻細(xì)胞，、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。 （三）細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)檢查 1、處理貼壁生長細(xì)胞時，吸出培養(yǎng)液，每瓶加入消化液各0.5mL，在37℃下消化1~2min后，加入約10mL培養(yǎng)液，用吸管沖洗細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。取0.5mL臺盼藍(lán)溶液、0.3 mL Hanks或D-Hanks液和0.2 mL 細(xì)胞懸液，充分混勻，然后，將混合液放置5~15min。 2、用吸管吸取少量混合液，注入血細(xì)胞計數(shù)板小室。將蓋玻片放在計數(shù)板上，用吸管吸取少量細(xì)胞懸液，充滿

21、間隙。在顯微鏡100倍放大用計數(shù)器計數(shù)4個大方格中的細(xì)胞。 3、至少計數(shù)500個細(xì)胞，并計數(shù)其中的著色細(xì)胞。 用雙蒸水和75%酒精清洗計數(shù)板和蓋玻片，然后，用檫鏡紙檫干。 4、結(jié)果分析： (1) 細(xì)胞密度（個/mL）=（四大格細(xì)胞數(shù)／4）×104。每個方格的積為1×10-4mL。 (2) 細(xì)胞總數(shù)（個）= 細(xì)胞濃度×細(xì)胞懸液量。 (3) 正常細(xì)胞不被染色。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜的通透性增大，臺盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，故細(xì)胞呈蘭色。 (4) 細(xì)胞活力（%）=（總細(xì)胞數(shù)— 著色細(xì)胞數(shù)）÷總細(xì)胞數(shù)×100% 四、思考題： 1、你認(rèn)為心肌細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作要點是什么？ 2、培養(yǎng)瓶移入CO2恒溫箱培養(yǎng)時，瓶蓋為何要稍松？ 3、如何初步判斷胰蛋白酶的消化時間？ 4、細(xì)胞培養(yǎng)到一定時間為何要進(jìn)行傳代？ 專心---專注---專業(yè)