血紅蛋白的提取和分離 基礎(chǔ)知識

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1、 第15課時　血紅蛋白的提取和分離 1.歸納蛋白質(zhì)多樣性的原因 (1)圖甲說明：氨基酸的種類不同，構(gòu)成的肽鏈不同。 (2)圖乙說明：氨基酸的數(shù)目不同，構(gòu)成的肽鏈不同。 (3)圖丙說明：氨基酸的排列次序不同，構(gòu)成的肽鏈不同。 (4)圖丁說明：肽鏈的數(shù)目和空間結(jié)構(gòu)不同，構(gòu)成的蛋白質(zhì)不同。 2.血液包括血細(xì)胞和血漿，血細(xì)胞又分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，其中紅細(xì)胞含有血紅蛋白，使紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。 3.紅細(xì)胞放到低滲溶液中，會吸收水分，體積膨脹直至漲破。 課堂導(dǎo)入 蛋白質(zhì)是生命活動不可缺少的物質(zhì)，隨著基因組測序工作的完成，人們對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用工作進(jìn)入了新的時代，這就需

2、要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此對蛋白質(zhì)的分離就是生物學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作，下面我們就以血紅蛋白的提取和分離來學(xué)習(xí)有關(guān)蛋白質(zhì)的一些基本技術(shù)。 探究點(diǎn)一　蛋白質(zhì)分離技術(shù) 生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，按照科學(xué)的需要有時要把它們分開，分離蛋白質(zhì)常使用的方法是凝膠色譜法和電泳法，都是根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子的之間的差異來分離的。 2 / 23 1.蛋白質(zhì)特性的差異 (1)分子的形狀和大??； (2)所帶電荷的性質(zhì)和多少； (3)溶解度； (4)吸附性質(zhì)； (5)對其他分子的親和力。 2.分離的方法 (1)凝膠色譜法 Ⅰ.概念：凝膠色譜法，也稱做分配色譜法，是根據(jù)相對分子質(zhì)量

3、的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。 Ⅱ.凝膠：是一些微小的多孔球體，大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的，內(nèi)含許多貫穿通道，具有多孔的凝膠又稱為分子篩。 Ⅲ.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理(如圖A) 相對分 子質(zhì)量 直徑大小 運(yùn)動方式 運(yùn)動 速度 運(yùn)動 路程 洗脫 次序 大 大于凝膠顆粒空隙直徑、被排阻在凝膠顆粒的外面 垂直向下移動 較快 較短 先從凝膠柱洗脫出來 小 小于凝膠顆?？障吨睆剑梢赃M(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 垂直向下移動，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒 較慢 較長 后從凝膠柱洗脫出來 Ⅳ.分離蛋白質(zhì)的過程(如圖B) ①蛋白質(zhì)混合物上柱； ②洗脫開始，相對

4、分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)；相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則被排阻于凝膠顆粒之外； ③相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)被滯留；相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)向下移動； ④相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子完全分開； ⑤相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)行程較短，已從層析柱中洗脫出來，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。 (2)電泳 ①概念：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。 ②原理：在同一電場下，由于各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身

5、大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 ③常用方法 a.瓊脂糖凝膠電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場中的遷移速率因各種分子帶電性質(zhì)的差異、分子大小和形狀的不同而不同，從而得以分離。 b.聚丙烯酰胺凝膠電泳 加入SDS作用：使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈；SDS能與各種蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。 (3)緩沖溶液 ①概念：在一定范圍內(nèi)，能夠抵制外界的酸、堿或稀釋的影響，維持pH基本不變的溶

6、液叫做緩沖溶液。 ②緩沖溶液的配制：緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 小貼士　緩沖溶液常見的有三類 (1)弱酸及其對應(yīng)鹽，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。 (2)多元弱酸的酸式鹽及其對應(yīng)的次級鹽，如：NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。 (3)弱堿及其對應(yīng)鹽，如NH3H2O—NH4Cl。 歸納提煉 凝膠色譜法和電泳法 凝膠色譜法分離分子是依據(jù)分子質(zhì)量大小，利用凝膠色譜柱使大分子優(yōu)先洗脫出來，而小分子后分離出來。電泳法分離分子則是依據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的

7、差異，以及分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)在電場中將各種分子分離。 活學(xué)活用 1.下列各項中，除哪項外均為電泳使樣品中各分子分離的原因(　　) A.分子帶電性質(zhì)的差異 B.分子的大小 C.分子的形狀 D.分子的變性溫度 [問題導(dǎo)析]　電泳法是在同一電場下，由于各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 答案　D 解析　電泳是指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。樣品分子的帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會影響帶電粒子在電場中的遷移速度，與分子的變性溫度無關(guān)，故選D項。

8、 探究點(diǎn)二　血紅蛋白的提取和分離 每一種蛋白質(zhì)的分離純化方法因其來源和性質(zhì)不同會有很大差異，下面以哺乳動物紅細(xì)胞為材料，學(xué)習(xí)初步分離蛋白質(zhì)的方法。 1.蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 2.樣品處理 (1)紅細(xì)胞的洗滌 ①目的：去除雜蛋白； ②方法：采集血樣，低速短時間離心，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水稀釋，再離心，重復(fù)三次，直至上清液中不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 (2)血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中： ①加蒸餾水到原血液的體積，其作用是使紅細(xì)胞吸水

9、漲破； ②加入40%體積的甲苯，其作用是溶解細(xì)胞膜； ③置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0 min，其作用是加速紅細(xì)胞破裂； ④紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。 (3)分離血紅蛋白溶液 ①將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以2 000 r/min的速度離心10 min，試管中的溶液分為4層： ②將試管中的液體用濾紙過濾、除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的紅色透明液體，即血紅蛋白溶液。 (4)透析 ①原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。 ②過程：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol

10、/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12 h。 ③目的：a.除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。b.用于更換樣品的緩沖液。 3.凝膠色譜柱的制作 (1)取長40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。 (2)柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗將橡皮塞上部包好。 (3)柱頂部制作：打孔→安裝玻璃管。 (4)將上述三部分按相應(yīng)位置組裝成一個整體。 4.凝膠色譜柱的裝填 (1)計算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算所需凝膠量 ↓ (2)凝膠溶脹：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液 ↓ (3)固定：將色譜柱垂直固定在支架上

11、 ↓ (4)裝填：將凝膠懸液一次性裝填入色譜柱內(nèi) ↓ (5)洗滌平衡：用20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH＝7.0)洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密 5.純度鑒定——電泳 判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。 歸納提煉 實(shí)驗(yàn)注意事項 (1)紅細(xì)胞的洗滌 ①離心速度與離心時間十分重要，離心轉(zhuǎn)速要低，時間要短，否則白細(xì)胞等會一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。 ②重復(fù)洗滌三次，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無法清除血漿蛋白。 (2)色譜柱填料的處理：為了加速干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的

12、濕凝膠用沸水浴加熱，通常只需1～2 h。這種方法不僅節(jié)約時間，還可除去凝膠中可能帶有的微生物，排出膠粒內(nèi)的空氣。 (3)凝膠色譜柱的裝填：在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 ①在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 ②在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。 (4)蛋白質(zhì)的分離：滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動狀況判斷收集流出液的時間。 活學(xué)活用 2.下列說法不正確的是(　　) A.在一定范圍內(nèi)

13、，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變 B.緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成 C.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程 D.透析袋能使大分子自由進(jìn)出，而將小分子保留在袋內(nèi) [問題導(dǎo)析]　透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。 答案　D 解析　透析袋一般是用硝酸纖維素(又叫玻璃紙)制成的。透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。透析可以除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。 1.用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)(　　) A.路程較長，移動速度較慢 B.路程較

14、長，移動速度較快 C.路程較短，移動速度較慢 D.路程較短，移動速度較快 答案　D 解析　凝膠顆粒內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。 2.在血紅蛋白分離過程中，使用緩沖液的作用是(　　) A.維持溶液濃度不變 B.維持溶液酸堿度不變 C.催化蛋白質(zhì)分離過程順利完成 D.無實(shí)際意義 答案　B 解析　分離蛋白質(zhì)時加入緩沖液，其原因是緩沖液在一定范圍內(nèi)能抵制外界酸和堿對反應(yīng)溶液pH

15、的影響，保持pH基本不變。 3.下列關(guān)于蛋白質(zhì)提取和分離實(shí)驗(yàn)中樣品處理步驟的敘述，正確的是(　　) A.紅細(xì)胞的洗滌：加入蒸餾水，緩慢攪拌，低速短時間離心 B.血紅蛋白的釋放：加入生理鹽水和甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢? C.分離血紅蛋白：將攪拌好的混合液離心，過濾后，用分液漏斗分離 D.透析：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，然后置于pH為4.0的磷酸緩沖液中透析12 h 答案　C 解析　紅細(xì)胞洗滌步驟中應(yīng)加入生理鹽水而不是蒸餾水，血紅蛋白釋放中加入蒸餾水，透析時緩沖液pH應(yīng)為7.0而不是4.0。 4.凝膠色譜柱制作成功的標(biāo)志是(　　) A.凝膠裝填緊密、均勻 B.凝膠色譜柱中有

16、氣泡 C.洗脫中，紅色區(qū)帶均勻一致地移動 D.洗脫中，紅色區(qū)帶偏向左邊移動 答案　C 解析　洗脫過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。 5.凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答下列問題： (1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是________，原因是_________________________

17、_______________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由__________________________替代。 (3)裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是__________

18、______________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)若選用Sephade

19、x G－100，則“G”表示______________________________________，100表示______________。 答案　(1)a　a相對分子質(zhì)量大，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快 (2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗　(3)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果　(4)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍　凝膠得水值 解析　用凝膠色譜法分離各種大分子物質(zhì)時，大分子物質(zhì)先洗脫出來，然后是小分子物質(zhì)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外

20、，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一個凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而落后于大分子物質(zhì)洗脫出來。在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。 基礎(chǔ)過關(guān) 知識點(diǎn)一　蛋白質(zhì)分離技術(shù) 1.利用凝膠色譜法先洗脫出來的蛋白質(zhì)是(　　) A.相對分子質(zhì)量大的 B.溶解度高的

21、C.相對分子質(zhì)量小的 D.所帶電荷多的 答案　A 解析　相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較長，移動速度較慢；相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)，路程較短，移動速度較快，首先洗脫出來。 2.凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法，但并非所有的蛋白質(zhì)都可以用此方法進(jìn)行分離，能分離的蛋白質(zhì)分子之間必須(　　) A.具有相同的相對分子質(zhì)量 B.相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較大的分子 C.相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較小的分子 D.具有不同的相對分子質(zhì)量 答案　C 解析　若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同

22、屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的，分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠。 3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點(diǎn)是(　　) A.改變蛋白質(zhì)分子通過凝膠時的路徑 B.吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動速度 C.將酶或細(xì)胞固定在凝膠中 D.與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動速度 答案　A 解析　凝膠的種類較多，但每種凝膠內(nèi)部都有孔隙。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，通過的路程較長，洗脫時從凝膠柱中出來的較晚，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子則可以較早地洗脫出來，從而

23、達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。 4.已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種物質(zhì)，其分子大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量情況如圖所示。下列敘述正確的是(　　) A.將樣品裝入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋內(nèi)，則分子甲也保留在袋內(nèi) B.若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，則用凝膠色譜柱分離時，甲的移動速度最快 C.將樣品以2 000 r/min的速度離心10 min，若分子戊存在于沉淀中，則分子丙也存在于沉淀中 D.若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)分子，則分子甲和分子戊形成的電泳帶相距最近 答案　C 解析　透析的原理是相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)能透過半透膜，相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)

24、不能透過，乙保留在袋內(nèi)，甲則不一定保留在袋內(nèi)；凝膠色譜柱分離時，相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)路程長、移動慢；離心時相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)先沉淀，戊沉淀，則乙、丁、丙均已沉淀；用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)時，電泳遷移率主要取決于分子大小。 知識點(diǎn)二　血紅蛋白的提取和分離 5.洗滌紅細(xì)胞時，離心所采用的方法是(　　) A.低速長時間離心 B.低速短時間離心 C.高速長時間離心 D.高速短時間離心 答案　B 解析　高速或長時間離心，會導(dǎo)致白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，得不到純凈的紅細(xì)胞，而影響后面血紅蛋白的提取純度。 6.對在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作，不正確的是(　　)

25、A.加樣前要使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊 B.讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動，貼壁加樣至色譜柱頂端，不要破壞凝膠面 C.打開下端出口，待樣品完全進(jìn)入凝膠層后，直接連接緩沖液，洗脫瓶開始洗脫 D.待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集流出液 答案　C 解析　打開下端出口，待樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，再用同樣的方法小心加入適量的20 mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，然后連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，開始洗脫。 7.在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對樣品處理過程的分析正確的是(　　) A.洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無

26、機(jī)鹽 B.洗滌時離心速度過小，時間過短，白細(xì)胞等會沉淀，達(dá)不到分離的效果 C.洗滌過程選用0.1%的生理鹽水 D.透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 答案　D 解析　洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中除血紅蛋白以外的雜蛋白；洗滌時離心速度過大，時間過長，白細(xì)胞等會沉淀，達(dá)不到分離的效果；洗滌過程選用0.9%的生理鹽水。 8.將處理破裂后的紅細(xì)胞混合液以2 000 r/min的速度離心10 min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是(　　) A.血紅蛋白、甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層 B.甲苯層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層、血紅蛋白、脂質(zhì)物質(zhì)層 C.脂

27、質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、甲苯層、紅細(xì)胞破碎物沉淀層 D.甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、紅細(xì)胞破碎物沉淀層 答案　D 解析　混合液經(jīng)離心后按密度大小排列，在離心管中從上到下的順序依次是：第1層為無色透明的甲苯層，第2層白色薄層固體是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第3層紅色透明液體是血紅蛋白水溶液，第4層暗紅色沉淀物主要是紅細(xì)胞破碎物沉淀。 能力提升 9.使用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過程，可表示為圖中(　　) 答案　B 解析　相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)留在顆粒外面，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入顆粒內(nèi)部；相對分子質(zhì)量大的通過凝膠間隙先被洗脫，相對分子質(zhì)量小的

28、進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。 10.蛋白質(zhì)的分離與純化是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是(　　) A.根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離 B.根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等，可通過電泳法分離蛋白質(zhì) C.根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) D.根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì) 答案　A 解析　蛋白質(zhì)分子是生物大分子，都不能通過半透膜，因此不能利用半透膜分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小可以使蛋白質(zhì)分子在電場中獲得不同的遷移速度，因此可以利用電泳法分離蛋白質(zhì)；蛋白

29、質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小不同，通過凝膠柱的時間不同，可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，具有不同的離心力，可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì)。 11.凝膠柱制作的順序一般是(　　) ①橡皮塞打孔?、谕诎佳ā、垩b玻璃管　④蓋尼龍網(wǎng) ⑤蓋尼龍紗?、迣⑾鹌と迦氩ＡЧ堋、呓幽猃埞?、裝螺旋夾　⑧柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞 A.①③④⑤⑥⑧⑦② B.①②③④⑤⑥⑦⑧ C.①②③④⑥⑤⑧⑦ D.①②③⑦⑥⑤⑧④ 答案　B 解析　凝膠柱制作的一般流程是：選擇玻璃管→選擇合適的橡皮塞→打孔→挖凹穴→蓋尼龍網(wǎng)→蓋尼龍紗→將橡皮塞插到玻璃管→接尼龍管→裝螺旋夾→柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞

30、。 12.下列關(guān)于電泳的說法，不正確的是(　　) A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程 B.帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動 C.蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少 D.用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小 答案　C 解析　蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。 13.下列操作正確的是(　　

31、) A.分離紅細(xì)胞時采用低速長時間離心 B.紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水即可 C.分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心 D.透析時要用20 mmol/L的磷酸緩沖液，透析12 h 答案　D 解析　分離紅細(xì)胞時，采用低速短時間離心，如500 r/min離心2 min；分離血紅蛋白溶液時，離心時間較長，如2 000 r/min離心10 min。釋放血紅蛋白時，加入蒸餾水和40%體積的甲苯；透析時用物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液，以除去相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。 14.血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中O2或CO2的運(yùn)輸。請根據(jù)血紅蛋白的提取和分

32、離流程圖回答問題。 (1)將實(shí)驗(yàn)流程補(bǔ)充完整：A為____________________________，B為____________________________。凝膠色譜法是根據(jù)______________________________而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的有效方法。 (2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除________，洗滌次數(shù)過少，無法除去________________；離心速度過高和時間過長會使________一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。洗滌干凈的標(biāo)志是______________________________________。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是__________

33、______。 (3)在洗脫過程中加入物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH為7.0)的目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 如果紅色區(qū)帶______________，說明色譜柱制作成功。 答案　(1)血紅蛋白的釋放　樣品的加入和洗脫　相對分子質(zhì)量的大小 (2)雜蛋白(血漿蛋白)　血漿蛋白　白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞

34、　離心后的上清液中沒有黃色　蒸餾水和甲苯 (3)準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內(nèi)一致　均勻一致地移動 解析　凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，在蛋白質(zhì)提取與分離過程中包括樣品的處理、粗分離、純化和純度鑒定四步，每一步均應(yīng)用了不同的操作技術(shù)，需要注意。 15.如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實(shí)驗(yàn)裝置，請據(jù)圖回答下列問題。 (1)血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細(xì)胞的主要組成成分，它在紅細(xì)胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質(zhì)具有__________功能。 (2)甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是___________________________________

35、______； 乙裝置中，C溶液的作用是___________________________________________________。 (3)甲裝置用于________，目的是______________________________________________。 用乙裝置分離蛋白質(zhì)的方法叫________________，是根據(jù)________________________分離蛋白質(zhì)的有效方法。 (4)用乙裝置分離血紅蛋白時，待____________________________________________時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。

36、 答案　(1)運(yùn)輸　(2)磷酸緩沖溶液　洗脫血紅蛋白　(3)透析(粗分離)　去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)　凝膠色譜法　相對分子質(zhì)量的大小　(4)紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端 解析　用透析法(如圖甲)對血紅蛋白進(jìn)行粗分離，將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，可以去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。血紅蛋白的純化采用凝膠色譜法(如圖乙)，血紅蛋白相對分子質(zhì)量較大，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路徑較短，移動速度較快，可以收集到紅色的蛋白質(zhì)。 個性拓展 16.紅細(xì)胞含有大量血紅蛋白，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取

37、和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題。 (1)實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。 ①加入檸檬酸鈉的目的是__________________________________________________ ②以上所述的過程即是樣品處理，它包括______________________________________、______________、收集血紅蛋白溶液。 (2)洗滌紅細(xì)胞的目的是___________________________________________________。 (3)你如何知道紅細(xì)胞已洗滌干

38、凈？ ________________________________________________________________________。 (4)分離紅細(xì)胞時的離心速度及離心時間分別是__________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)若離心速度過高和時間過長結(jié)果會怎樣？ _________________________________________________________________

39、_______。 (6)將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進(jìn)行透析，即樣品的粗分離。 ①透析的目的是__________________________________________________________。 ②透析的原理是__________________________________________________________。 答案　(1)①防止血液凝固?、诩t細(xì)胞的洗滌　血紅蛋白的釋放 (2)去除血漿蛋白 (3)離心后的上清液沒有黃色 (4)低速500 r/min；短時間如2 min (5)離心速度過高和時間過長會使白細(xì)胞等一同沉淀，得不到純凈的紅

40、細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度 (6)①去除分子量較小的雜質(zhì)?、谕肝龃苁剐》肿幼杂蛇M(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi) 解析　人或哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中無細(xì)胞核和細(xì)胞器，雜質(zhì)相對較少，提取血紅蛋白相對較容易，而其他動物如鳥類、兩棲類等動物紅細(xì)胞中含細(xì)胞核及大量的細(xì)胞器，不易提取血紅蛋白。為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑檸檬酸鈉。樣品的處理包括紅細(xì)胞洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液。洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜質(zhì)蛋白，以利于后續(xù)步驟分離純化。重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。采集的血樣要及時分離紅細(xì)胞，分離時采取低速短時間離心，如500 r/min離心2 m

41、in。若離心速度過高和時間過長會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一起沉淀，得不到純凈紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白提取的純度。 溫馨提示：最好仔細(xì)閱讀后才下載使用，萬分感謝！