《中國藥典》薄層色譜的基本要求.ppt

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1、中國藥典薄層色譜的基本要求 周蘭貴州省食品藥品檢驗所中藥（民族藥）室 2014年5月 內(nèi)容薄層色譜技術(shù)在中藥標準的優(yōu)勢中國藥典薄層色譜的基本要求薄層色譜應(yīng)用的影響因素 薄層色譜技術(shù)在中藥標準的優(yōu)勢薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄 B），系將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分分離，將所得色譜圖與對照物按同法所得的色譜圖比較，并可用薄層掃描儀進行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定的方法。 薄層色譜技術(shù)在中藥標準的優(yōu)勢薄層色譜獨有的特點是分析結(jié)果以直觀的彩色圖像表達，為其它色譜技術(shù)所不能。而圖像給出的多層面的信息是文字難以表達的，而且豐富多彩的圖像可以給分析者更多

2、的思考判斷的空間。 提供直觀的彩色圖像是薄層色譜獨有的特點 離線操作的靈活性各單元操作既有關(guān)聯(lián)，又相互獨立，點樣器材和方法、展開方式、顯色試劑選擇、直觀比較或掃描比較可根據(jù)需要靈活變通。根據(jù)需要操作可以視實際需要和實驗室條件分層次進行和終止，節(jié)省分析時間和資源。 由于是離線操作，所以個人占機時間短。 正相色譜流動相（展開劑）的廣泛適用性薄層色譜最常用的是以硅膠板為基礎(chǔ)固定相的正相色譜，有多種組合的有機溶劑展開系統(tǒng)可供選擇；甲苯系統(tǒng)；三氯甲烷系統(tǒng)；己烷系統(tǒng)；正丁醇系統(tǒng)；乙酸乙酯系統(tǒng)等等。 酸性、堿性、中性。高極性、中等極性、低極性。 色譜后衍生的專屬性色譜后靈活方便的衍生技術(shù)，同一色譜薄層板可生

3、成可見光譜、紫外光譜、熒光淬滅光譜或熒光光譜，給出豐富的檢測成分的化學類別信息。如三氯化鋁試劑是黃酮類化合物的專屬試劑；碘化鉍鉀是生物堿類成分的專屬試劑；三氯化鐵是酚類成分的專屬試劑；醋酐硫酸是三萜類和甾醇類成分的專屬試劑等。硫酸則是許多成分激發(fā)產(chǎn)生熒光的通用試劑，非常方便。 同板多個樣品平行比較成本相對低廉、色譜生成快速、同板可以同時產(chǎn)生多達1618個樣品色譜，共平行直觀地比較，色彩豐富的圖像給人的視覺沖擊遠遠大于較為“呆板”的輪廓色譜圖，可以迅速地、粗略地，而且頗為有效地評價樣品色譜圖像之間的相試程度。 中 國 藥 典 薄 層 色 譜 的 基 本 要 求供 起 草 標 準 用 樣 品 的

4、要 求中 成 藥 薄 層 色 譜 鑒 別中 藥 材 薄 層 色 譜 鑒 別 中藥標準制定技術(shù)要求原 則 保 證 用 藥 安 全科 學 、 先 進 、 規(guī) 范 、 適 用促 進 標 準 國 際 化 中藥標準制定技術(shù)要求中 藥 標 準 制 定 國 家 藥 品 標 準 工 作 手 冊 中 藥 質(zhì) 量 標 準 研 究 制 定 技 術(shù) 要 求方 法 學 驗 證 中 藥 質(zhì) 量 標 準 方 法 學 驗 證 指 導 原 則（ 中 國 藥 典 2010版 一 部 ） 供起草用樣品的要求研 究 用 樣 品 應(yīng) 具 有 代 表 性 ， 覆 蓋 面 要 廣 ，一 般 至 少 收 集 15批 以 上 樣 品 供 研

5、究 用 ；對 于 多 來 源 品 種 ， 每 種 收 集 35種 ； 相 關(guān) 信 息 包 括 ： 產(chǎn) 地（ 如 有 可 能 表 明 野 生 或 家 種 ） 、 收 集 地 、 收 集 時 間 、 收 集 人獨 家 生 產(chǎn) 的 應(yīng) 不 少 于 10批 ， 多 家 企 業(yè) 生 產(chǎn) 的 應(yīng) 盡 量 收 集每 家 企 業(yè) 的 樣 品 ， 5家 以 上 企 業(yè) 生 產(chǎn) 的 應(yīng) 至 少 收 集 510家企 業(yè) 生 產(chǎn) 的 樣 品 樣 品 量 除 滿 足 起 草 研 究 、 留 樣 觀 察 外 ， 還 應(yīng) 有 不 少于 3倍 檢 驗 量 的 樣 品 供 復(fù) 核 用 供起草用樣品的要求注 意 中 藥 材 、

6、飲 片 要 求 專 家 鑒 定對 于 具 有 多 種 不 同 規(guī) 格 的 中 成 藥 ， 應(yīng) 收 齊 全 部 規(guī) 格 的 樣 品 試 驗 用 樣 品 必 須 采 用 合 格 原 輔 料 依 法 生 產(chǎn) 的 樣 品 ， 收 集 的 每 批樣 品 均 要 有 該 企 業(yè) 的 原 輔 料 和 成 品 的 自 檢 報 告 及 詳 細 生 產(chǎn) 工 藝 供起草用樣品的要求陰 性 對 照 樣 品 生 產(chǎn) 單 位 應(yīng) 盡 可 能 提 供研 究 單 位 自 制陰 性 樣 品 系 指 按 處 方 除 去 被 測 定 的 藥 味 ， 按 制 法 制 備 的樣 品 ， 注 意 應(yīng) 包 括 所 有 的 輔 料 和 工

7、藝 步 驟 ， 制 成 量 應(yīng) 與原 標 準 相 符 鑒別鑒 別 顯 微 鑒 別理 化 鑒 別色 譜 鑒 別 特 征 圖 譜 鑒 別 一 般 理 化 鑒 別熒 光 鑒 別光 譜 鑒 別薄 層 色 譜 鑒 別液 相 色 譜 鑒 別氣 相 色 譜 鑒 別 中藥材薄層色譜鑒別盡 量 采 用 對 照 品 和 對 照 提 取 物 或 對 照 藥 材 同 時 進 行 對 照圖 譜 清 晰 、 斑 點 明 顯 、 分 離 度 與 重 現(xiàn) 性 符 合 要 求根 據(jù) 被 測 物 的 特 性 選 擇 合 適 的 固 定 相 、 展 開 劑 及 顯色 方 法 等 色 譜 條 件色 譜 條 件 的 優(yōu) 化 應(yīng) 對 三

8、 個 以 上 的 展 開 系 統(tǒng) 進 行 考 察 確 定 供 試 品 取 樣 量 、 提 取 和 純 化 方 法 、 點 樣 量 等 條 件選 擇 合 適 的 對 照 物 質(zhì) ， 確 定 對 照 物 質(zhì) 用 量 、濃 度 、 溶 劑 、 點 樣 量 等 中藥材薄層色譜鑒別驗 證 專 屬 性重 復(fù) 性耐 用 性 重 現(xiàn) 性 多 來 源 藥 材 、 飲 片 的 色 譜 行 為 是否 一 致混 淆 品 的 區(qū) 別斑 點 是 否 重 疊不 同 品 牌 的 薄 層 板 或 自 制 薄 層 板 考 察考 察 至 少 23個 品 牌 或 廠 家 的 薄 層 板 ，不 同 溫 度 、 濕 度 考 察 ， 在

9、5 35考 察 高 低 2個 溫 度 ； 在 低 相 對 濕 度（ RH） 1530%和 高 相 對 濕 度 7590%各 考 察 一 個 相 對 濕 度 中 成 藥 薄 層 色 譜 鑒 別（ 1） 薄 層 色 譜 具 有 分 離 與 鑒 別 的 特 性 ， 并 具 有 直 觀 、 承 載 信息 大 、 專 屬 性 強 、 快 速 、 經(jīng) 濟 、 操 作 簡 便 等 優(yōu) 點 ， 是 中 成藥 鑒 別 的 首 選 方 法 。（ 2） 新 建 立 的 薄 層 色 譜 應(yīng) 該 圖 譜 清 晰 ， 斑 點 明 顯 ， 分 離度 、 專 屬 性 、 重 現(xiàn) 性 與 耐 用 性 符 合 要 求 ， 并 需

10、 要 提 供 圖 譜 ；（ 3） 應(yīng) 盡 量 與 該 藥 材 和 飲 片 的 薄 層 色 譜 鑒 別 方 法 一 致 ， 如 因 其 他 成 分干 擾 或 制 劑 的 提 取 方 法 不 同 ， 可 增 加 提 取 純 化 處 理 或 展 開 劑 優(yōu) 化 。 新增薄層色譜鑒別要求供 試 品 溶 液 的 制 備 ： 應(yīng) 盡 可 能 除 去 干 擾 ， 同 時 方 法 盡 量 簡 便 ，首 先 進 行 提 取 、 純 化 選 擇 ， 如 回 流 、 超 聲 提 取 方 法 ， 溶 劑 、 時 間 ，酸 堿 處 理 ， 溶 劑 萃 取 ， 柱 子 純 化 等 的 選 擇對 照 品 選 擇 ： 盡 量

11、 采 用 以 對 照 品 和 對 照 提 取 物 或 對 照 藥 材 同 時 進 行對 照 。 當 對 照 品 不 易 獲 得 時 ， 可 采 用 對 照 提 取 物 或 對 照 藥 材 為 對 照薄 層 板 的 選 擇 ： 吸 附 劑 的 比 較 ， 選 硅 膠 G板 還 是 GF254板 新 增 薄 層 色 譜 鑒 別 要 求點 樣 量 選 擇 ： 不 同 點 樣 量 的 比 較展 開 劑 選 擇 ： 對 三 個 以 上 的 展 開 系 統(tǒng) 進 行 考 察 比 較顯 色 條 件 選 擇 ： 日 光 、 紫 外 光 、 顯 色 劑陰 性 空 白 試 驗 ： 以 證 明 其 他 藥 味 無 干

12、 擾耐 用 性 ： 不 同 廠 牌 的 薄 層 板 、 溫 度 、 相 對 濕 度 等 注 意（ 1） 使 用 對 照 藥 材 應(yīng) 保 證 藥 材 的 主 斑 點 在 樣 品 中 均 有 對 應(yīng) 斑 點 （ 可 參照 制 法 對 藥 材 進 行 前 處 理 ） ， 供 試 品 色 譜 中 不 能 只 有 對 照 藥 材 色 譜 中 的12個 次 要 斑 點 相 對 應(yīng)（ 2） 盡 可 能 采 取 一 個 供 試 液 多 項 多 維 鑒 別 使 用 的 薄 層 色 譜 方 法 ， 達 到節(jié) 約 資 源 、 保 護 環(huán) 境 、 簡 便 實 用 的 目 的（ 3） 注 意 ” 過 柱 “ 的 影 響

13、 ， 不 同 品 牌 、 不 同 批 號 的 吸 附 劑 吸 附 能 力 有 的 不 同（ 4） 對 原 方 法 的 驗 證 注 意 原 標 準 點 樣 量 按 手 鋪 板 制 定 ， 現(xiàn) 用 市 售 薄 層 板 點 樣 量 過 大 分 離 度 差 ， 點 樣 量 可 減 少 薄層色譜應(yīng)用的影響因素樣品預(yù)處理薄層色譜的點樣技術(shù)吸附劑活性溶劑蒸汽在薄層色譜中的應(yīng)用溫濕度對薄層色譜的影響 薄層色譜的優(yōu)化及溶劑系統(tǒng)（展開劑）的選擇薄層板 樣品預(yù)處理要得到一個較為清晰的色譜，樣品提取物經(jīng)預(yù)處理，使供試品溶液得以凈化，往往是一個重要的有時甚至是關(guān)鍵的步驟提取溶劑的要求：溶解度不宜太大，黏度不宜太高，沸點

14、適中 供試品溶液凈化的方法（ 1） 單 一 溶 劑 提 取 法 根 據(jù) 被 測 物 質(zhì) 的 化 學 特 性 ， 有 選 擇 性 地 采 用 某 種 溶 劑 直接 提 取 制 備 。 （ 如 浙 貝 母 、 平 貝 母 、 華 山 參 、 洋 金 花 等 ）（ 2） 分 段 提 取 法 ； 被 檢 測 樣 品 不 同 極 性 部 位 分 別 提 取 后 制 成 相 應(yīng) 供 試 液 ，分 別 檢 測 分 析 （ 如 丹 參 ）（ 3） 特 殊 提 取 方 式 如 蜜 丸 等 含 糖 較 高 又 有 黏 性 的 樣 品 ， 有 機 溶 劑 較 難 滲 透到 樣 品 的 內(nèi) 部 ， 可 加 硅 藻 土

15、 、 滑 石 粉 等 分 散 劑 共 同 研 勻 后再 提 取 。 供試品溶液凈化的方法（ 4） 液 -液 萃 取 法 利 用 樣 品 與 雜 質(zhì) 在 兩 相 （ 水 相 和 有 機 相 ） 中 溶 解 度 的 不同 ， 達 到 凈 化 目 的 。 特 別 適 合 合 劑 、 口 服 液 、 糖 漿 劑 、 注 射 劑 等 的 處 理 。（ 5） 固 -液 萃 取 法 固 相 小 柱 萃 取 基 本 上 是 基 于 吸 附 、 鍵 合 相 分 配 、 正 相 、 反相 、 離 子 對 、 離 子 交 換 原 理 富 集 待 測 成 分 ， 去 除 部 分 雜 質(zhì)。 點樣 點 狀 或 條 帶 狀

16、 點 樣 ？ 點 狀 點 樣 ： 簡 單 快 速 缺 點 ： 接 觸 式 點 樣 ， 易 損 傷 薄 層 板 表 面 點 樣 量 小 斑 點 容 易 點 大 ， 易 產(chǎn) 生 容 積 環(huán) 形 色 譜 效 應(yīng) ， 影 響 分 離 效 果 條 帶 狀 點 樣 優(yōu) 點 ： 一 般 噴 霧 式 ， 不 損 傷 薄 層 板 表 面 點 樣 量 比 點 狀 點 樣 大 原 點 不 會 上 下 擴 散 ， 分 離 度 增 加 點樣點多少？ 常規(guī)的TLC：0.5-5 l， 高效TLC：HPTLC： 1 l；用什么點？ 常規(guī)：手工一般使用定量毛細管（0.5/1/2和5 l），點樣是毛細管必須完全充滿和完全排空，要

17、以垂直方向小心接觸TLC/ HPTLC板面，（玻璃毛細管不易損傷預(yù)制板的板面），切忌斑點或條帶在原點因溶劑過大造成原點的擴散，一般建議控制在5 l以下。 裝置：手工點樣器 半自動點樣器 全自動點樣器 展開-展開溶劑使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”有毒試劑如“苯”禁用，“三氯甲烷”慎用（三氯甲烷目前仍有使用，否則許多鑒別無法進行，有的例子是難以取代的）；溶劑組成采用體積比（如乙酸乙酯-甲醇-甲酸=8:2:0.1，或?qū)懽?0:20:1 V/V/V)。甲酸一般雖然用量很微，但應(yīng)準確加入。 溶劑總量應(yīng)足以使薄層板的浸入深度約為5mm（展開劑量的多少會影響斑點的Rf值）展開劑要求新鮮配制，一般不用

18、多次反復(fù)使用，如展開溶劑混合放置后有分層現(xiàn)象，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。 展開-飽和與預(yù)平衡溶劑的蒸氣相在展開缸中也參與色譜展開而形成三維的層析過程，即固相-板上的吸附劑、液相-展開劑、氣相-溶劑蒸氣三相相互作用；如處理不好，會產(chǎn)生如下現(xiàn)象： 展開過程中展開劑的組分被固定相分離產(chǎn)生第二前沿。 未平衡或平衡時間不夠易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。 該怎樣飽和呢？展開缸預(yù)平衡或飽和：展開前將展開劑置展開缸中，其蒸氣在展開缸中平衡一段時間（15-20min）后迅速放入薄層板展開；預(yù)吸附：將薄層板放在展開缸中，不與展開劑接觸，吸附一定量的溶劑蒸氣可以改變層析行為，得到不同的色譜； 飽和方式方

19、法A（展開缸、薄層板均不飽和）方法B（展開缸飽和、薄層板不飽和）方法C（展開缸、薄層板均飽和） 展開-展開劑優(yōu)化展開劑在色譜展開中起著關(guān)鍵作用，至今植物藥分析的薄層展開劑的優(yōu)化基本上還是依靠經(jīng)驗。主要是因為植物藥含有太多的未知成分，色譜行為各不相同，所以試錯法仍然是中藥分析實驗室在選擇展開劑時最常用的方法（包括借鑒他人的經(jīng)驗） 展開劑的優(yōu)化主要考慮兩方面：溶劑的極性和溶劑的選擇性。 前者要求使待分離的主要物質(zhì)的Rf值在0.30.7之間；當Rf值符合要求后，進行等強度溶劑替換，直到分離度達到要求為止。對于硅膠等吸附薄層和正相分配色譜來說，展開劑的極性越大，溶劑強度就越大，洗脫能力就越強，即同一物

20、質(zhì)在薄層板上的Rf值越大。 根據(jù)文獻和樣品所含化合物類型選擇，并記錄色譜純?nèi)軇┰鰷p溶劑強度混合，改性試劑，添加酸堿、水等獲得最佳配比 常用溶劑的極性順序水（最大） 甲酰胺乙腈甲醇乙醇 丙醇丙酮二氧六環(huán)四氫呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚異丙醚二氯甲烷三氯甲烷溴乙烷笨四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油（最小） 展開-展開距離是不是展距越大越好呢？ TLC:12-15cm HPTLC:5-7cm建議對展距進行考察，選擇最佳展距，并做好記錄 溫度對薄層色譜的影響一般而言，溫度越低，Rf值越低；展開溫度對薄層色譜的影響不大，一般相差5時，Rf值的變動一般不會超過0.02；因此，展開溫度一般控制在1525 之間

21、即可（一般空調(diào)實驗室均能解決）； 記錄試驗時的實際溫度。 相對濕度對薄層色譜的影響一般而言，濕度越低， Rf值越低；相對濕度是影響薄層色譜重現(xiàn)性差的主要原因之一；不同樣品或成分和所選用的展開劑對相對濕度的適應(yīng)能力不同； 因此，建議展開的濕度一般控制在50%記錄試驗時實際的相對濕度 相對濕度的控制方法相對濕度（%）所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）水（ml）1 8 1 0 0 9 5 .53 2 6 8 1 0 04 2 5 7 1 0 04 7 5 0 1 0 05 8 3 9 .5 1 0 06 5 3 4 1 0 07 2 2 7 .5 1 0 08 8 1 0 .8 1 0 0 顯色對同

22、一薄層板在UV254、365nm、可見光（衍生前和/或后）下觀察 給出豐富的化學結(jié)構(gòu)類型信息； TLC板上常含有UV指示劑（F-254），在UV254nm激發(fā)下產(chǎn)生有色熒光。對UV254nm有吸收的物質(zhì)存在于斑點上時發(fā)射的熒光會減弱（熒光淬滅）； 噴霧 優(yōu)點：快速、方便、試劑消耗少； 缺點：會產(chǎn)生有毒霧氣，重現(xiàn)性是個問題。浸漬 優(yōu)點：顯色均勻 缺點：試劑消耗量大，產(chǎn)生溶劑線，背景染色深； 顯色劑考察對顯色劑考察原則： 用對照品對照的樣品，通常選用針對對照品的專屬性顯色劑，如生物堿類藥材，選用改良碘化鉍鉀試液； 用對照藥材對照的樣品，通常選用顯色劑如10%硫酸乙醇溶液顯色；或選用針對該樣品活性成分或?qū)傩猿煞值膶傩燥@色劑。加熱顯色者須注意加熱的時間和溫度（做好時間和溫度的記錄） 有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時間長短不同或放置時間不同均可能使斑點的顯色有所改變。 檢視分析結(jié)果采用相機或薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（CAMAG）記錄