《生物信息的傳遞上》PPT課件

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1、n1、什么是DNA的半保留復(fù)制？n2、DNA復(fù)制的生物學(xué)意義是什么？n3、原核生物中主要有那幾種DNA聚合酶？請(qǐng)說(shuō)出它們的主要功能？n4、說(shuō)出人類細(xì)胞中最大的和最小的染色體，它們各有多少bp。 n 5、說(shuō)出DNA作為遺傳物質(zhì)的最基本特征。n 6、有什么證據(jù)說(shuō)明染色體可能是由核小體組成的？n 7、大腸桿菌DNA完全伸展時(shí)有多長(zhǎng)？n 8、重疊基因是怎樣發(fā)現(xiàn)的，是從哪種生物里首次發(fā)現(xiàn)的？ 3 生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA 主要內(nèi)容n轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程n轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分n啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始n原核和真核生物mRNA的特征比較n終止和抗終止n內(nèi)含子的剪接、編輯、再編碼及化學(xué)修飾 n基因作為唯一能夠自主

2、復(fù)制、永久存在的單位，其生物學(xué)功能是以RNA或蛋白質(zhì)的形式表達(dá)出來(lái)的。DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過(guò)自主復(fù)制得到永存，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成信使RNA，翻譯生成蛋白質(zhì)的過(guò)程來(lái)控制生命現(xiàn)象。 n基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個(gè)階段。n轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了TU之外）的RNA單鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的核心步驟。n翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的最終目的。 nDNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內(nèi)所有RNA及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，還通過(guò)蛋白質(zhì)（酶）的功能間接控制

3、了細(xì)胞內(nèi)全部有效成份的生產(chǎn)、運(yùn)轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。 Francois Jacob (Left), Jacques Monod (Center) & Andre Lwoff (Right) n與mRNA序列相同的那條DNA鏈?zhǔn)蔷幋a鏈（coding strand）或稱有意義鏈（sense strand），另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈則被稱為模板鏈（template strand）或稱反義鏈（antisensestrand）。 DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關(guān)系 nDNA和RNA雖然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學(xué)活性卻很不同。RNA主要

4、以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，它們既擔(dān)負(fù)著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。 n因?yàn)橹挥衜RNA所攜帶的遺傳信息才被用來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來(lái)表示遺傳性狀。 n生物體內(nèi)擁有三類RNA，即：n編碼特定蛋白質(zhì)序列的mRNA；n能特異性解讀mRNA 中的遺傳信息并將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸后加入多肽鏈中的tRNA；n直接參與核糖體中蛋白質(zhì)合成的rRNA。 3.1 RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程n無(wú)論是原核還是真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程都包括： 模板識(shí)別 轉(zhuǎn)錄起始 通過(guò)啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄的延伸 轉(zhuǎn)錄的終止 大腸桿菌中依賴于

5、DNA的RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程圖示。轉(zhuǎn)錄泡中單鏈DNA的長(zhǎng)度約在17bp左右，被聚合酶復(fù)合物所保護(hù)的DNA序列約為35bp左右。 n3. 1. 1 模板識(shí)別模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程。n啟動(dòng)子（promoter）是基因轉(zhuǎn)錄起始所必需的一段DNA序列，是基因表達(dá)調(diào)控的上游順式作用元件。 n真核生物RNA聚合酶不能直接識(shí)別基因的啟動(dòng)子區(qū)，需要一些被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的輔助蛋白質(zhì)按特定順序結(jié)合于啟動(dòng)子上，RNA聚合酶才能與之相結(jié)合并形成復(fù)雜的前起始復(fù)合物（preinitiation transcription complex, PIC），以保證有效地起始轉(zhuǎn)錄。

6、n3.1.2 轉(zhuǎn)錄起始n轉(zhuǎn)錄起始不需要引物，啟動(dòng)子附近的DNA雙鏈分開(kāi)形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)。n轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。 n轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)啟動(dòng)子階段，此時(shí)RNA聚合酶一直處于啟動(dòng)子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來(lái)并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開(kāi)始。 n一旦RNA聚合酶成功地合成9個(gè)以上核苷酸并離開(kāi)啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)入正常的延伸階段。所以，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間代表一個(gè)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。n一般說(shuō)來(lái)，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。 n3.1.3 轉(zhuǎn)錄延伸nRNA聚合酶離開(kāi)啟動(dòng)子，沿DNA鏈移

7、動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過(guò)程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。n大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個(gè)核苷酸。隨著RNA聚合酶的移動(dòng)，DNA雙螺旋持續(xù)解開(kāi)，暴露出新的單鏈DNA模板，新生RNA鏈的3末端不斷延伸，在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。 n 3.1.4 轉(zhuǎn)錄終止n轉(zhuǎn)錄到終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA聚合物分離，DNA恢復(fù)，RNA及RNA聚合酶釋放。n 37時(shí)，轉(zhuǎn)錄生成mRNA的速度大約是每分鐘2500個(gè)核苷酸，即每秒鐘合成14個(gè)密碼子，而蛋白質(zhì)合成的速度大約是每秒鐘15個(gè)氨基酸。正常情況下，從一個(gè)基因開(kāi)始表達(dá)到細(xì)胞中出現(xiàn)其mRNA的間隔約為2.5分鐘，而再

8、過(guò)半分鐘就能在細(xì)胞內(nèi)測(cè)到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 n3. 2 轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分n3.2.1 RNA聚合酶nRNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中最關(guān)鍵的酶，主要以雙鏈DNA為模板，以4種核苷三磷酸作為活性前體，并以Mg2+/Mn2+為輔助因子，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，它不需要任何引物，催化生成的產(chǎn)物是與DNA模板鏈相互補(bǔ)的RNA。 nRNA或RNA-DNA雙鏈雜合體不能作為模板。n原核和真核生物的RNA聚合酶雖然都能催化RNA的合成，但在其分子組成、種類和生化特性上各有特色。 n1. 原核生物的RNA聚合酶n大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌聚合酶由2個(gè)亞基、一個(gè)亞基、一個(gè)亞基和一個(gè)亞基組成

9、，稱為核心酶。加上一個(gè)亞基后則成為聚合酶全酶（holoenzyme），相對(duì)分子質(zhì)量為4.65105。 大腸桿菌RNA聚合酶的主要成分 大腸桿菌RNA聚合酶的主要成分 表3-1 大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對(duì)分子量*104亞基數(shù)組分功能 rpoA 3.65 2核心酶核心酶組裝，啟動(dòng)子識(shí)別 rpoB 15.1 1核心酶和共同形成RNA合成的活性中心 rpoC 15.5 1核心酶 11 1核心酶未知 rpoD 7 1 因子存在多種因子，用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子 n亞基可能與核心酶的組裝及啟動(dòng)子識(shí)別有關(guān)，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用。nT4噬菌體感染大腸桿菌后對(duì)亞基的一個(gè)精氨酸殘

10、基進(jìn)行ADP糖基化修飾，造成RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子親和力降低。 n由和亞基組成了聚合酶的催化中心，它們?cè)谛蛄猩吓c真核生物RNA聚合酶的兩個(gè)大亞基有同源性。亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。 n因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識(shí)別模板上的啟動(dòng)子。核心酶在T7噬菌體DNA上約有1300個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，平均結(jié)合常數(shù)為21011。 n因子可以極大地提高RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的親和力，酶底結(jié)合常數(shù)提高103倍，酶底復(fù)合物的半衰期可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)十小時(shí)。n因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異性位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)降低104倍，使酶底復(fù)合物的

11、半衰期小于1秒。 表3-2 大腸桿菌中的因子能識(shí)別并與啟動(dòng)子區(qū)的特異性序列相結(jié)合因子基因功能-35區(qū)間隔bp -10區(qū)70 ropD廣泛TTGACA 16-18 TATAAT32 ropH熱休克TCTCNCCCTTGAA 13-15 CCCCATNTA 54 ropN氮代謝CTGGNA 6 TTGCA n枯草桿菌中有6種不同相對(duì)分子質(zhì)量的因子，其中55是主要存在形式，出現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中，29則主要出現(xiàn)在胞子形成階段，參與胞子形成期基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。n在大腸桿菌中，最常見(jiàn)的調(diào)控因子是由rpoD基因所編碼的70。 n由rpoH編碼的32是與熱休克啟動(dòng)子所控制的基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。n由rpoN編碼的54則

12、參與細(xì)胞的氮代謝。由T4噬菌體所編碼的55能與大腸桿菌RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，啟動(dòng)T4晚期基因的轉(zhuǎn)錄。 n2.真核生物RNA聚合酶n真核生物中有3類RNA聚合酶，其結(jié)構(gòu)比大腸桿菌RNA聚合酶復(fù)雜，它們?cè)诩?xì)胞核中的位置不同，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的基因不同，對(duì)-鵝膏覃堿的敏感性也不同。n真核生物RNA聚合酶一般有8-14個(gè)亞基所組成，相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)5105。 真核生物RNA聚合酶的主要特征：n聚合酶中有兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)1105的大亞基；n同種生物3類聚合酶有“共享”小亞基的傾向，即有幾個(gè)小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的。 表3-3 真核細(xì)胞中三類RNA聚合酶特性比較酶定位產(chǎn)物相對(duì)活性對(duì)-鵝膏覃堿的

13、敏感程度RNA聚合酶I核仁rRNA 50 % 70%不敏感RNA聚合酶II核質(zhì)hnRNA 20%40%敏感RNA聚合酶III核質(zhì)tRNA約10%物種特異性 n 3.2.2 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物n啟動(dòng)子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別，聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closed complex，此時(shí)，DNA仍處于雙鏈狀態(tài)）。n然后，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開(kāi)放復(fù)合物（open complex），聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開(kāi)。對(duì)于強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，從封閉復(fù)合物到開(kāi)放復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應(yīng)。 nRNA合成的起始 n開(kāi)放復(fù)合物與最初的兩個(gè)NTP相結(jié)合并在這兩個(gè)核苷酸之間形成

14、磷酸二酯鍵后即轉(zhuǎn)變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元復(fù)合物。除RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中至少還需要7種輔助因子參與。 一般情況下，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑：n合成并釋放2-9個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；n盡快釋放亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過(guò)上游啟動(dòng)子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。 n轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物較為穩(wěn)定，可長(zhǎng)時(shí)間與DNA模板結(jié)合而不解離。只有在遇到轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)時(shí)，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA雜合物解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并導(dǎo)致聚合酶本身從模板DNA上脫落。 3.3 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始n轉(zhuǎn)錄起始是基

15、因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問(wèn)題是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)影響了它與RNA聚合酶的親和力，從而影響了基因表達(dá)的水平。 n大腸桿菌RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用主要包括啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別、酶與啟動(dòng)子的結(jié)合及因子的結(jié)合與解離。 n3. 3. 1 啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)n啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。 n轉(zhuǎn)錄單元（transcription unit）是一段從啟動(dòng)子開(kāi)始至終止子（terminator）結(jié)束的DNA序列。 n轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是指與新生RNA鏈第一個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基，通常為嘌呤

16、。把起點(diǎn)5末端的序列稱為上游（upstream），而把其3末端的序列稱為下游(downstream)。起點(diǎn)為+1，下游方向依次為+2、+3等，上游方向依次為1、2、3等等。 n啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)nPribnow將RNA聚合酶全酶與模板DNA結(jié)合后，用DNaseI降解DNA，得到4144個(gè)核苷酸對(duì)的DNA片段。n序列分析發(fā)現(xiàn)，在被保護(hù)區(qū)內(nèi)有一個(gè)由5個(gè)核苷酸組成的保守序列，是聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，稱為Pribnow區(qū)，其中央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱為-10區(qū)。 分離轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA序列程序圖 n科學(xué)家又從噬菌體的左、右啟動(dòng)子PL及PR和SV40啟動(dòng)子的-35 bp附近找到了另一段共同序列：TTGA

17、CA。n現(xiàn)已證實(shí)大部分啟動(dòng)子都存在這兩段共同序列，即位于-10 bp處的TATA區(qū)和-35 bp處的TTGACA區(qū)，它們是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)。 大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識(shí)別的啟動(dòng)子區(qū) 35區(qū) 10區(qū)T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100n在真核生物基因中，Hogness等發(fā)現(xiàn)類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)，在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-25-30 bp處，保守序列為TATAAA，也稱TATA區(qū)。在起始位點(diǎn)上游-70-78 bp處還有另一段共同序列CCAAT，稱為CAAT區(qū)（CAAT box）。 n真核基因的啟動(dòng)子在2535區(qū)含有TATA序列，在7080區(qū)

18、含有CCAAT序列（CAAT box），在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。習(xí)慣上，將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動(dòng)子元件（upstream promoter element，UPE）或稱上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）。 n如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會(huì)使該啟動(dòng)子發(fā)生下降突變；如果增加Pribnow區(qū)的共同序列，將乳糖操縱子的啟動(dòng)子中的TATGTT變成TATATT，就會(huì)提高啟動(dòng)子的效率，稱為上升突變。3.3.2 啟動(dòng)子區(qū)及上游序列作用 TATA區(qū)的作用nTATA區(qū)的主要作用是使

19、轉(zhuǎn)錄精確地起始。如果除去TATA區(qū)或進(jìn)行堿基突變，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物下降的相對(duì)值不如CAAT區(qū)或GC區(qū)突變后明顯，但發(fā)現(xiàn)所獲得的RNA產(chǎn)物起始點(diǎn)不固定。 nCAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。nSV40的早期基因，缺少TATA和CAAT區(qū)，只有6個(gè)串聯(lián)在上游40110位點(diǎn)的GC區(qū)；而組蛋白H2B，不含GC區(qū)，但有兩個(gè)CAAT區(qū)，一個(gè)TATA區(qū)。CAAT和GC區(qū)的作用 真核細(xì)胞中的部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分析 上游激活序列作用n研究SV40晚期基因啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，上游激活區(qū)的存在與否，對(duì)該啟動(dòng)子的生物活性有著根本性的影響。若將該基因5 上游-21-47核苷酸序列切除，基因完全不表達(dá)。 3

20、.3.3 RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合n聚合酶首先與啟動(dòng)子區(qū)閉合雙鏈DNA結(jié)合，形成閉合復(fù)合物，經(jīng)解鏈得到開(kāi)鏈復(fù)合物。解鏈區(qū)一般在-9+13，酶與啟動(dòng)子結(jié)合在其上游。n RNA聚合酶即是雙鏈DNA結(jié)合蛋白又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。 3.3.4 增強(qiáng)子及其功能n在SV40的轉(zhuǎn)錄單元上發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約200bp處有兩段72bp長(zhǎng)的重復(fù)序列，它們不是啟動(dòng)子的一部分，但能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始，因此，稱這種能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子（enhancer）。 n遠(yuǎn)距離效應(yīng)n無(wú)方向性n順式調(diào)節(jié)n無(wú)物種、基因特異性n組織特異性n相位性n對(duì)外應(yīng)答(部分) 3.3.5 轉(zhuǎn)錄抑制n DNA模版抑制劑

21、放線菌素Dn RNA聚合酶抑制物 利福霉素、利迪鏈霉素、-鵝膏蕈堿 表 轉(zhuǎn)錄的抑制劑抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細(xì)菌全酶和亞基結(jié)合，抑制起始利迪鏈霉素細(xì)菌核心酶和亞基結(jié)合，抑制起始放線菌素D真核Pol和DNA結(jié)合，阻止延伸-鵝膏蕈堿真核Pol和RNA Pol結(jié)合 3. 4 原核與真核生物mRNA的特征比較n mRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)占總RNA的2%左右，tRNA占16%，rRNA則占80%以上。n真核細(xì)胞的mRNA往往以較大相對(duì)分子量的前體RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對(duì)分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學(xué)修飾的mRNA才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細(xì)胞mRNA的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空

22、間和時(shí)間范疇內(nèi)。 3. 4. 1 原核生物mRNA的特征n1.半衰期短n原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯是在同一個(gè)細(xì)胞空間里同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開(kāi)始轉(zhuǎn)錄時(shí)就被引發(fā)了。 53 DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象（電鏡模擬圖）核糖體RNARNA聚合酶 n大多數(shù)細(xì)菌mRNA在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始1分鐘后就開(kāi)始降解。降解的速度大概只有轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)每過(guò)大約2分鐘，體系中出現(xiàn)新生蛋白質(zhì)的速度就下降50%。 n2.原核細(xì)胞的mRNA（包括病毒）有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽，而真核細(xì)胞的mRNA最多只能編碼一個(gè)多肽。n把只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順?lè)醋觤RNA (monocistro

23、nic mRNA)，把編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順?lè)醋觤RNA (polycistronic mRNA)。 n幾乎所有mRNA都可以被分成3部分：編碼區(qū)和位于AUG之前的5端上游非編碼區(qū)以及位于終止密碼子之后不翻譯的3端下游非編碼區(qū)。編碼區(qū)從起始密碼子AUG開(kāi)始經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼子直至終止密碼子。 n第一個(gè)蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板，第二個(gè)蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該蛋白起始密碼子相結(jié)合后才可能開(kāi)始。n前一個(gè)多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，小亞基也可能不離開(kāi)mRNA模板，而是迅速與游離的大亞基結(jié)合，啟動(dòng)第二個(gè)多肽的合成。 n一個(gè)順

24、反子的翻譯有時(shí)完全取決于它前面順?lè)醋拥姆g，因?yàn)橹挥械谝粋€(gè)翻譯起始位點(diǎn)是暴露的，在這個(gè)順?lè)醋臃g產(chǎn)生多肽的過(guò)程中，核糖體的運(yùn)動(dòng)破壞了后續(xù)順?lè)醋拥亩?jí)結(jié)構(gòu)，使起始位點(diǎn)較容易與核糖體相結(jié)合形成起復(fù)合物。 n3. 原核生物mRNA的5端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3端沒(méi)有或只有較短的多聚A結(jié)構(gòu)。n原核生物起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處有一被稱為SD序列（Shine Dalgarno sequence）的保守區(qū)，因?yàn)樵撔蛄信c16S-rRNA 3端反向互補(bǔ)，所以被認(rèn)為在核糖體-mRNA的結(jié)合過(guò)程中起作用。 n4.原核生物常以AUG（有時(shí)GUG，甚至UUG）作為起始密碼子，而真核生物幾乎永遠(yuǎn)以AUG作為起始密碼子

25、。 n3. 4. 2 真核生物mRNA的特征n編碼功能蛋白的真核基因都通過(guò)RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，幾乎都是單順?lè)醋?，其長(zhǎng)度在幾百到幾千個(gè)核苷酸之間。n一個(gè)完整的基因，不但包括編碼區(qū)（coding region），還包括5 和3 端長(zhǎng)度不等的特異性序列，它們雖然不編碼氨基酸，卻在基因表達(dá)的過(guò)程中起著重要作用。 n“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。真核生物mRNA結(jié)構(gòu)上的最大特征是5端的帽子及3的多聚(A) 結(jié)構(gòu)。nA gene can be defined as following: The entire nucleic acid sequence t

26、hat is necessary for the synthesis of a functional polypeptide or RNA molecule. n1. 真核生物mRNA的5端存在“帽子”結(jié)構(gòu)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄一般從嘌呤（主要是A，也可能是G）起始，其5端大都經(jīng)過(guò)修飾，第一個(gè)核苷酸保留了5端的三磷酸基團(tuán)。 n用核酸酶處理成熟mRNA，其5端并不產(chǎn)生預(yù)期的核苷三磷酸，而產(chǎn)生以5-5三磷酸基團(tuán)相連的二核苷酸。n5 端是一個(gè)在mRNA轉(zhuǎn)錄后加上去的甲基化鳥(niǎo)嘌呤。 nmRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。第一個(gè)甲基出現(xiàn)在所有真核細(xì)胞的mRNA中（單細(xì)胞真核生物mRNA主要是這個(gè)結(jié)構(gòu)），由尿苷酸

27、-7甲基轉(zhuǎn)移酶催化，稱為零類帽子（cap0）。 n如在第二個(gè)核苷酸(原mRNA 5第一位)的2-OH位上加另一個(gè)甲基，這步反應(yīng)由2-O-甲基轉(zhuǎn)移酶完成。一般把有這兩個(gè)甲基的結(jié)構(gòu)稱為1類帽子（cap1），真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主。n當(dāng)mRNA原第一位核苷酸是A時(shí)，其N6位有時(shí)也被甲基化，這一反應(yīng)只能在2-OH被甲基化以后才能發(fā)生。 n在某些生物細(xì)胞內(nèi)，mRNA鏈上的原第二個(gè)核苷酸的2-OH位也可能被甲基化，因?yàn)檫@個(gè)反應(yīng)只以帶有1類帽子的mRNA為底物，所以被稱為2類帽子（cap2）。有2類帽子的mRNA只占有帽mRNA總量的10%-15%以下。 n2. 絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚A尾巴

28、n除組蛋白基因外，真核生物mRNA的3末端都有多聚A序列，其長(zhǎng)度因mRNA種類不同而變化，一般為40-200個(gè)左右。 n真核基因的3 末端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)上游1530bp處的保守序列AAUAAA對(duì)于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確切割及加多聚A是必需的。 n多聚A是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式，它大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。mRNA剛從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，其多聚A尾巴一般比較長(zhǎng)，隨著mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逗留時(shí)間延長(zhǎng)，多聚A逐漸變短消失，mRNA進(jìn)入降解過(guò)程。 3. 5 終止和抗終止nRNA聚合酶啟始基因轉(zhuǎn)錄后，就沿模板53方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈直到碰上終止信號(hào)時(shí)才與模板DNA相脫離并釋放

29、新生RNA鏈。所有參與形成RNA-DNA雜合體的氫鍵都被破壞，模板DNA鏈與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。 n3. 5. 1 不依賴于因子的終止n終止位點(diǎn)上游一般有一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)。在模版鏈終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTT

30、T. 3 DNA UUUU. UUUU. G3莖環(huán)/發(fā)夾結(jié)構(gòu) n新生RNA中出現(xiàn)發(fā)夾式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域，兩者共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來(lái)。 n終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U的長(zhǎng)短有關(guān)，隨著發(fā)夾式結(jié)構(gòu)（至少6bp）和寡聚U序列（至少4個(gè)U）長(zhǎng)度的增加，終止效率逐步提高。 n3. 5. 2 依賴于因子的終止nRNA聚合酶不能識(shí)別特異性的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，而加入大腸桿菌因子后該聚合酶就能在DNA模板上準(zhǔn)確地終止轉(zhuǎn)錄。因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2.0105的六聚體蛋白，它通過(guò)催化NTP的水解

31、促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離。 ATP 依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止 nRNA合成起始以后，因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著53方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3-OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放mRNA，完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。 3.6 內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾n3. 6. 1 RNA中的內(nèi)含子n因?yàn)檎婧嘶虮磉_(dá)往往伴隨著RNA的剪接過(guò)程（splicing），從mRNA前體分子中切除被稱為內(nèi)含子（intron）的非編碼區(qū)，并使基因中被稱為外顯子（exon）的編碼區(qū)拼接形成成熟mRNA。 圖 用DNA-RNA雜交的方法驗(yàn)證雞卵

32、清蛋白基因中存在非編碼的內(nèi)含子區(qū)。a. 成熟mRNA與帶有該基因的互補(bǔ)鏈DNA序列雜交示意圖；b. 雞卵清蛋白的基因結(jié)構(gòu)示意圖。 n真核基因大多是斷裂的，也就是說(shuō)，一個(gè)基因可由多個(gè)內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。研究表明，內(nèi)含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超過(guò)99%。 部分人類基因中內(nèi)含子序列所占的比重分析基因長(zhǎng)度/bp內(nèi)含子數(shù)量?jī)?nèi)含子占比胰島素1.4 2 67-球蛋白1.4 2 69血清蛋白18 13 89膠原蛋白組分VII 31 117 71VIII因子186 25 95萎縮性肌強(qiáng)直因子2400 78 99 n由DNA轉(zhuǎn)錄生成的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物核不均一RNA（hnRNA, heterogene

33、ous nuclear RNA），即mRNA的前體，經(jīng)過(guò)5加“帽”和3酶切加多聚腺苷酸，再經(jīng)過(guò)RNA的剪接，編碼蛋白質(zhì)的外顯子部分就連接成為一個(gè)連續(xù)的可譯框（open reading frame，ORF），通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，作為蛋白質(zhì)合成的模板。 RNA加工過(guò)程及其生理功能加工過(guò)程推測(cè)的生理功能加帽子反應(yīng)mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)，翻譯起始加多聚A反應(yīng)轉(zhuǎn)錄終止，翻譯起始和mRNA降解RNA的剪接從mRNA, tRNA和rRNA分子中切除內(nèi)含子RNA的切割從前體RNA中釋放成熟tRNA和rRNA分子 原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生成及其主要加工剪接過(guò)程圖示 n真核基因平均含有8-10個(gè)內(nèi)含子，前體分子一般

34、比成熟mRNA大4-10倍。n內(nèi)含子的“功能”及其在生物進(jìn)化中的地位是一個(gè)引人注目的問(wèn)題。n許多人類疾病是內(nèi)含子剪接異常引起的。地中海貧血病人的珠蛋白基因中，大約有1/4的核苷酸突變發(fā)生在內(nèi)含子的5或3邊界保守序列上，或者直接干擾了前體mRNA的正常剪接。 n表3-9總結(jié)了存在于生物體內(nèi)的各種內(nèi)含子，其中GU-AG或AU-AC分別代表了不同內(nèi)含子的5和3邊界序列。除了邊界序列之外，外顯子與內(nèi)含子交界處的序列，內(nèi)含子內(nèi)部的部分序列都有可能參與內(nèi)含子的剪接。 表3-9 生物體內(nèi)的各種內(nèi)含子內(nèi)含子類型細(xì)胞內(nèi)定位GU-AG細(xì)胞核，前體mRNA （真核）AU-AC細(xì)胞核，前體mRNA（真核）I類內(nèi)含子細(xì)

35、胞核，前體rRNA（真核），細(xì)胞器RNA，少數(shù)細(xì)菌RNAII類內(nèi)含子細(xì)胞器RNA，部分細(xì)菌RNAIII類內(nèi)含子細(xì)胞器RNA雙內(nèi)含子細(xì)胞器RNAtRNA前體中的內(nèi)含子細(xì)胞核，tRNA前體（真核） 3. 6. 2 RNA的剪接n轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的核內(nèi)mRNA前體分子與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA和蛋白質(zhì)組成的RNP復(fù)合物（ribonucleo-protein particle）。隨著RNA鏈的延伸，每個(gè)內(nèi)含子5和3兩端的復(fù)合物成對(duì)聯(lián)結(jié)，產(chǎn)生60S的顆粒剪接體(spliceosome)，進(jìn)行RNA前體分子的剪接。 脊椎動(dòng)物前體mRNA中常見(jiàn)內(nèi)含子剪接所必需的保守序列5剪接位位點(diǎn)相鄰的保守序列5-AGGUAAGU-

36、33剪接位位點(diǎn)相鄰的保守序列5-PyPyPyPyPyPyNCAG3 n由U1 snRNA以堿基互補(bǔ)的方式識(shí)別mRNA前體5剪接點(diǎn)，由結(jié)合在3剪接點(diǎn)上游富嘧啶區(qū)的U2AF（U2 auxiliary factor）識(shí)別3剪接點(diǎn)并引導(dǎo)U2 snRNP與分支點(diǎn)相結(jié)合，形成剪接前體（pre-spliceosome）。n剪接前體進(jìn)一步與U4、U5、U6 snRNP三聚體相結(jié)合，形成剪接體。 n哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mRNA前體上的snRNP是從5向下游“掃描”，選擇在分支點(diǎn)富嘧啶區(qū)3下游的第一個(gè)AG作為剪接的3受點(diǎn)。nAG前一位核苷酸可以影響剪接效率，一般說(shuō)來(lái)，CAG=UAGAAGGAG。n如果mRNA前體上同時(shí)

37、存在幾個(gè)AG，可能發(fā)生剪接競(jìng)爭(zhēng)。 n在高等真核生物個(gè)體發(fā)育或細(xì)胞分化過(guò)程中可以有選擇性地越過(guò)某些外顯子或某個(gè)剪接點(diǎn)進(jìn)行變位剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA，稱為內(nèi)含子的變位剪接。n脊椎動(dòng)物中大約有5%的基因能以這種方式進(jìn)行剪接，保證各同源蛋白質(zhì)之間既具有大致相同的結(jié)構(gòu)或功能域，又具有特定的性質(zhì)差異，進(jìn)而拓展了基因所攜帶的遺傳信息。 n與mRNA前體中主要（GU-AG類）和次要（AU-AC類）內(nèi)含子的剪接方式不同的是I、II類內(nèi)含子，因?yàn)閹в羞@些內(nèi)含子的RNA本身具有催化活性，能進(jìn)行內(nèi)含子的自我剪接。 n在I類內(nèi)含子切除體系中，鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸的3-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5端的磷酸二酯鍵

38、，從上游切開(kāi)RNA鏈。再由上游外顯子的自由3-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開(kāi)，上下游兩個(gè)外顯子通過(guò)新的磷酸二酯鍵相連。 自由鳥(niǎo)苷酸的3-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5端的磷酸二酯鍵，從上游切開(kāi)RNA鏈。上游外顯子的自由3-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開(kāi)。I類內(nèi)含子的自我剪接過(guò)程 n在II類內(nèi)含子切除體系中，內(nèi)含子本身的某個(gè)腺苷酸2-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5端的磷酸二酯鍵，從上游切開(kāi)RNA鏈后形成套索狀結(jié)構(gòu)。再由上游外顯子的自由3-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開(kāi)，上下游兩個(gè)外

39、顯子通過(guò)新的磷酸二酯鍵相連。 II型內(nèi)含子的剪切機(jī)制 內(nèi)含子本身的某個(gè)腺苷酸2-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5端的磷酸二酯鍵。上游外顯子的3-OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3位 核苷酸上的磷酸二酯鍵，使套索結(jié)構(gòu)完全解離。 Thomas R. CechUniversity of ColoradoBoulder, CO, USA n Thomas Robert Cech (December 8, 1947 in Chicago) is a Nobel Laureate in chemistry.n He grew up in Iowa City, Iowa. In 1966, he entered Gr

40、innell College where he obtained a B.A. in 1970. In 1975, Cech completed his Ph.D. in Chemistry at the University of California, Berkeley and in the same year, he entered the Massachusetts Institute of Technology where he engaged in postdoctoral research. In 1978, he obtained his first faculty posit

41、ion at the University of Colorado where he lectured undergraduate students in chemistry and biochemistry, and where he remains on the faculty, currently as Distinguished Professor in the Department of Chemistry and Biochemistry. n In December 2006 it was reported that he was among the candidates bei

42、ng considered for the presidency of Harvard University. n1983年Altman 等人在研究大腸桿菌RNase P時(shí)發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)部分除去后，只剩下約400個(gè)核苷酸的RNA單獨(dú)存在，在體外高濃度Mg2+存在下，也具有完成切割rRNA前體的功能，并證明了此RNA分子具有全酶的活性。 n Sidney Altman，1939年3月7日，生于魁北克蒙特利爾），加拿大分子生物學(xué)家，現(xiàn)任耶魯大學(xué)分子、細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)及化學(xué)教授。 3. 6. 3 RNA的編輯和化學(xué)修飾nRNA的編輯（RNA editing）是某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式

43、n編輯的mRNA序列發(fā)生了不同于模板DNA的變化，導(dǎo)致遺傳信息的改變。 n載脂蛋白基因編碼區(qū)共有4563個(gè)密碼子。在肝臟中，該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生完整的mRNA并被翻譯成有4563個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為5.1105。在腸中合成的卻是只包含有2153個(gè)密碼子的mRNA，翻譯產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量為2.5105的蛋白質(zhì)。 n研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白其實(shí)是全長(zhǎng)載脂蛋白的N端，它是由一個(gè)在序列上除了2153位密碼子從CAA突變?yōu)閁AA之外完全與肝臟mRNA相同的核酸分子所編碼的，CU突變使編碼谷氨酰胺的密碼子變成了終止密碼子。 哺乳動(dòng)物載脂蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的編輯 nRNA的編輯雖然不是很普遍，但在真核生物中卻

44、時(shí)有發(fā)生。n大鼠腦中谷氨酸受體蛋白mRNA經(jīng)編輯后，多個(gè)編碼谷氨酸的密碼子變成了在控制通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)的離子流過(guò)程中有重要影響的精氨酸，表明RNA的編輯可能是充分發(fā)揮生理功能所必須的。 n核酶(Ribozyme) 是Cech等(1981年)在研究四膜蟲(chóng)rRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的，1982年Cech將核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）這兩個(gè)詞“重組”成一個(gè)新的詞 “Ribozyme”,它是指本質(zhì)為RNA或以RNA為主含有蛋白質(zhì)輔基的一類物質(zhì)。n核酶具有催化功能，和酶區(qū)別主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：酶是蛋白質(zhì)，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；核酶既是催化劑又是底物，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，本身也消失了。而酶卻不同，僅催化反應(yīng)，反應(yīng)前后其本身的質(zhì)和量都不發(fā)生改變。