《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》PPT課件.ppt

《《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》PPT課件.ppt》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》PPT課件.ppt（143頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn)Biochemical Experiment 實(shí) 驗(yàn) 基 本 知 識 容 量 瓶 液 體 的 量 取 液 體 的 傾 倒 滴 管 的 使 用 試 紙 的 使 用 一 定 質(zhì) 量 分 數(shù) 的 溶 液 的 配 制 濾 紙 的 折 疊 物 質(zhì) 分 離 與 提 純 過 濾 萃 取 與 分 液 實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容 安 排共 36學(xué) 時(shí)1、 緒 論 生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 規(guī) 則 及 常 用 儀 器 使 用 入 門 （ 2學(xué) 時(shí) ） 2、 實(shí) 驗(yàn) 一 紙 層 析 分 離 鑒 定 氨 基 酸 （ 6學(xué) 時(shí) ） 3、 實(shí) 驗(yàn) 二 血 清 蛋 白 醋 酸 纖 維 素 薄 膜 電 泳 （ 4學(xué)

2、 時(shí) ） 4、 實(shí) 驗(yàn) 三 蛋 白 質(zhì) 的 顏 色 反 應(yīng) （ 2學(xué) 時(shí) ） 5、 實(shí) 驗(yàn) 四 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀 、 變 性 反 應(yīng) （ 3學(xué) 時(shí) ） 6、 實(shí) 驗(yàn) 五 凝 膠 過 濾 法 除 蛋 白 質(zhì) 中 的 離 子 （ 4學(xué) 時(shí) ） 7、 實(shí) 驗(yàn) 六 酵 母 RNA的 提 取 和 鑒 定 (4學(xué) 時(shí) ) 8、 實(shí) 驗(yàn) 七 血 糖 含 量 的 測 定 （ 4學(xué) 時(shí) ）9、 實(shí) 驗(yàn) 八 脂 肪 酸 的 -氧 化 （ 5學(xué) 時(shí) ）10、 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 講 解 及 考 核 （ 2學(xué) 時(shí) ） 1 實(shí) 驗(yàn) 目 的l 掌 握 蛋 白 質(zhì) 、 酶 、 核 酸 、 糖 等 重 要 物 質(zhì) 的 分

3、離 、純 化 和 測 定 技 術(shù) 的 原 理 及 方 法 ；l 掌 握 生 物 化 學(xué) 的 基 本 知 識 、 基 本 理 論 及 基 本 實(shí)驗(yàn) 技 能 ；l 培 養(yǎng) 分 析 和 解 決 問 題 能 力 以 及 嚴(yán) 謹(jǐn) 細(xì) 致 的 科 學(xué)作 風(fēng) 、 創(chuàng) 新 能 力 等 綜 合 素 質(zhì) 。 緒 論 2 通 過 生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 應(yīng) 該 做 到l 學(xué) 習(xí) 設(shè) 計(jì) 一 個(gè) 實(shí) 驗(yàn) 的 基 本 思 路 ， 掌 握 各 個(gè) 實(shí)驗(yàn) 的 基 本 原 理 ， 學(xué) 會 嚴(yán) 密 地 組 織 自 己 的 實(shí) 驗(yàn) ，合 理 地 安 排 實(shí) 驗(yàn) 步 驟 和 時(shí) 間 。l 訓(xùn) 練 實(shí) 驗(yàn) 的 動(dòng) 手 能 力 ， 學(xué)

4、 會 熟 練 地 使 用 各 種生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 儀 器 。l 學(xué) 會 準(zhǔn) 確 翔 實(shí) 地 記 錄 實(shí) 驗(yàn) 現(xiàn) 象 和 數(shù) 據(jù) 的 技 能 ，提 高 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 的 寫 作 能 力 ， 能 夠 整 齊 清 潔 地進(jìn) 行 所 有 的 實(shí) 驗(yàn) 。l 掌 握 生 物 化 學(xué) 的 各 種 基 本 實(shí) 驗(yàn) 方 法 和 實(shí) 驗(yàn) 技術(shù) ， 尤 其 是 各 種 電 泳 技 術(shù) 和 層 析 枝 術(shù) ， 為 今后 參 加 科 研 工 作 打 下 堅(jiān) 實(shí) 的 基 礎(chǔ) 。 3.1 實(shí) 驗(yàn) 記 錄u實(shí) 驗(yàn) 前 寫 好 實(shí) 驗(yàn) 預(yù) 習(xí) 報(bào) 告 (鋼 筆 和 園 珠 筆 )。 u實(shí) 驗(yàn) 中 應(yīng) 及 時(shí) 準(zhǔn) 確 地

5、 記 錄 (專 用 紙 ， 事 先 在 記 錄 紙 上設(shè) 計(jì) 好 各 種 記 錄 格 式 和 表 格 ） 所 觀 察 到 的 現(xiàn) 象 和 測量 的 數(shù) 據(jù) 。u實(shí) 驗(yàn) 記 錄 要 注 意 有 效 數(shù) 字 ， 如 吸 光 度 值 應(yīng) 為“ 0.050” ， 而 不 能 記 成 “ 0.05” 。 每 個(gè) 結(jié) 果 都 要 盡可 能 重 復(fù) 觀 測 二 次 以 上 ， 即 使 觀 測 的 數(shù) 據(jù) 相 同 或 偏差 很 大 ， 也 都 應(yīng) 如 實(shí) 記 錄 ， 不 得 涂 改 。u實(shí) 驗(yàn) 中 要 詳 細(xì) 記 錄 實(shí) 驗(yàn) 條 件 ， 如 使 用 的 儀 器 型 號 、編 號 、 生 產(chǎn) 廠 等 ； 生 物

6、 材 料 的 來 源 、 試 劑 的 規(guī) 格 、試 劑 的 濃 度 等 。 3 實(shí) 驗(yàn) 記 錄 與 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 3 實(shí) 驗(yàn) 記 錄 與 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告3.2 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 的 格 式 應(yīng) 為 ： 實(shí) 驗(yàn) 目 的 ； 實(shí) 驗(yàn) 原 理 ； 儀 器 、 材 料 和 試 劑 ； 實(shí) 驗(yàn) 步 驟 ； 結(jié) 果 討 論 （ 含 數(shù) 理 據(jù) 處 ） ； 注 意 事 項(xiàng) ; (7) 思 考 題 注 意 ： 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 的 討 論 要 充 分 ， 盡 可 能 多 查 閱 一 些 有關(guān) 的 文 獻(xiàn) 和 教 科 書 ， 充 分 運(yùn) 用 己 學(xué) 過 的 知 識 和 生 物 化學(xué) 原 理 ， 進(jìn)

7、行 深 入 的 探 討 ， 勇 于 提 出 自 己 獨(dú) 到 的 分 析和 見 解 ， 并 歡 迎 對 實(shí) 驗(yàn) 提 出 改 進(jìn) 意 見 。 4 實(shí) 驗(yàn) 成 績 評 分 方 法n 實(shí) 驗(yàn) 預(yù) 習(xí) 情 況 （ 10%） n 實(shí) 驗(yàn) 操 作 情 況 （ 20%） n 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 情 況 （ 70%） 生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 理 論層 析 技 術(shù) l 1903年 ， 俄 國 科 學(xué) 家 M.C.Jber首 創(chuàng) 了 一 種 從 綠 葉中 分 離 多 種 不 同 顏 色 色 素 成 分 的 方 法 ， 命 名 為 色譜 法 (Chromatography)， 由 于 翻 譯 和 習(xí) 慣 的 原因

8、 又 常 稱 為 層 析 法 。l 80多 年 來 ， 層 析 法 不 斷 發(fā) 展 ， 形 式 多 種 多 樣 。 50年 代 開 始 ， 相 繼 出 現(xiàn) 了 分 配 層 析 、 離 于 交 換 層 析 、凝 膠 層 析 、 親 和 層 析 、 吸 附 層 析 等 。l 幾 乎 每 一 種 層 析 法 都 已 發(fā) 展 成 為 一 門 獨(dú) 立 的 生 化高 技 術(shù) ， 在 生 化 領(lǐng) 域 內(nèi) 得 到 了 廣 泛 的 應(yīng) 用 。一 、 層 析 技 術(shù) 一 、 層 析 技 術(shù)l 1、 層 析 技 術(shù) 原 理l 2、 層 析 技 術(shù) 分 類l 3、 常 用 層 析 技 術(shù) 原 理 1、 層 析 技 術(shù)

9、 原 理l 層 析 原 理 ： 是 一 種 物 理 的 分 離 方 法 ， 利 用 混 合物 中 各 組 分 的 物 理 化 學(xué) 性 質(zhì) 的 差 別 ， 使 各 組 分以 不 同 程 度 分 布 在 兩 相 中 ， 其 中 一 相 為 固 定 相 ，另 一 相 流 過 此 相 稱 作 流 動(dòng) 相 ， 并 使 各 組 分 以 不同 速 度 移 動(dòng) ， 從 而 達(dá) 到 分 離 的 目 的 。l 可 分 離 物 質(zhì) ： 糖 類 、 有 機(jī) 酸 、 氨 基 酸 、 核 苷 酸 。 2、 層 析 技 術(shù) 分 類名 稱 操 作 方 式 固 定 相 流 動(dòng) 相 分 離 依 據(jù)分 配 層 析 紙 層 析薄 層

10、 層 析 液 體 液 體 溶 解 度離 子 交 換 層 析 離 子 交 換 柱 層 析 固 體 液 體 帶 電 性靜 電 引 力吸 附 層 析 吸 附 薄 層 層 析氣 體 吸 附 層 析 固 體固 體 液 體氣 體 吸 附 力親 合 層 析 酶 與 底 物抗 原 與 抗 體 固 體 液 體 配 體 專 一 性凝 膠 層 析 凝 膠 過 濾 固 體 液 體 分 子 大 小 3、 常 用 的 層 析 原 理l （ 1） 分 配 層 析 紙 層 析l 原 理 ： 溶 質(zhì) 在 互 不 相 溶 的 兩 相 中 溶 解 度 不 同 ，在 終 點(diǎn) 時(shí) 達(dá) 到 一 種 平 衡 ， 其 比 值 為 一 個(gè) 常

11、 數(shù) ，即 分 配 系 數(shù) （ ） 。l 固 定 相 內(nèi) 溶 質(zhì) 的 濃 度 流 動(dòng) 相 內(nèi) 溶 質(zhì) 的 濃 度 固 定 相 ： 濾 紙 上 吸 附 的 水 流 動(dòng) 相 ： 有 機(jī) 溶 劑 （ 正 丁 醇 ） = 128 6464 326432 16484816 8324832 8 4204040 20 4 2123040 30 12 2 紙 層 析l 紙 層 析 是 最 簡 單 的 液 一 液 相 分 配 層 析 。l 濾 紙 是 紙 層 析 的 支 持 物 。 當(dāng) 支 持 物 被 水 飽 和 時(shí) ，大 部 分 水 分 子 被 濾 紙 的 纖 維 素 牢 牢 吸 附 ， 因 此 ，紙 及 其

12、 飽 和 水 為 層 析 的 固 定 相 ， 與 固 定 相 不 相混 溶 的 有 機(jī) 溶 劑 為 層 析 的 流 動(dòng) 相 。l 對 某 些 特 定 化 合 物 ， 在 特 定 的 展 層 系 統(tǒng) ， 一 定的 溫 度 條 件 下 ， Rf是 個(gè) 常 數(shù) 。 （ 2） 離 子 交 換 層 析l 原 理 ： 將 能 與 周 圍 介 質(zhì) 進(jìn) 行 離 子 交 換 的 不 穩(wěn) 定 離 子 固定 于 惰 性 基 質(zhì) 上 ， 從 而 分 離 介 質(zhì) 中 的 組 分 。l 常 用 的 惰 性 基 質(zhì) ： 人 工 合 成 樹 脂 （ 單 體 ： 苯 乙 烯 、 交聯(lián) 劑 ： 二 乙 烯 苯 ）l 陽 離 子

13、交 換 劑 ： 磺 酸 甲 基 、 羧 甲 基 、 磷 酸 基l 陰 離 子 交 換 劑 ： 二 乙 基 胺 乙 基 、 三 乙 基 胺 乙 基 l 可 交 換 離 子 ： 陽 離 子 ： Na+、 H+ 陰 離 子 ： Cl-、 OH- 示 意 圖 （ 交 換 樹 脂 表 面 ） 示 意 圖 （ 離 子 交 換 過 程 ）電 離 基 團(tuán) （ 磺 酸 根 ）可 交 換 離 子 （ 鈉 離 子 ）交 換 離 子不 交 換 離 子 示 意 圖 水 分 子B物 質(zhì) A物 質(zhì) （ 3） 吸 附 層 析l 原 理 ： 當(dāng) 氣 體 或 液 體 中 某 組 分 的 分 子 在 運(yùn) 動(dòng) 中 碰 到 一 個(gè) 固

14、 體 表 面時(shí) ， 分 子 會 貼 在 固 體 表 面 上 并 停 留 一 定 時(shí) 間 然 后 才 離 開 ， 此 為 吸附 現(xiàn) 象 。l 吸 附 現(xiàn) 象 形 成 的 原 因 ： 吸 附 作 用 可 能 由 幾 種 作 用 力 形 成 ， 包 括 被吸 附 物 與 吸 附 劑 之 間 相 反 電 荷 基 團(tuán) 與 基 團(tuán) 之 間 的 靜 電 引 力 (形 成 離子 鍵 )、 氫 鍵 及 范 德 華 引 力 等 。l 在 不 同 條 件 下 ， 占 主 要 地 位 的 作 用 力 可 能 不 同 ， 也 可 能 幾 種 力 同時(shí) 起 作 用 l 吸 附 劑 ： 氧 化 鋁 、 活 性 炭 、 硅

15、膠 ； 纖 維 素 、 淀 粉 、 聚 酰 胺 ； 滑 石 、陶 土 、 粘 土 。 吸 附 層 析 示 意 圖 吸 附 劑易 吸 附 分 子不 易 吸 附 分 子 （ 4） 親 和 層 析l 原 理 ： 利 用 分 子 間 具 有 專 一 親 和 力 而 設(shè) 計(jì) 的 層 析技 術(shù) 。l 專 一 親 和 力 分 子 對 ： 酶 與 底 物 、 特 異 性 抗 原 與抗 體 、 DNA和 RNA、 激 素 和 其 受 體l 載 體 ： 使 親 和 物 固 相 化 的 水 不 溶 性 化 合 物 。 如 ：纖 維 素 、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 、 瓊 脂 糖 凝 膠 、 聚 苯 乙烯 、 乙

16、 烯 、 多 孔 玻 璃 。 （ 5） 凝 膠 過 濾l 原 理 ： 被 分 離 物 質(zhì) 因 分 子 大 小 不 同 ， 在 凝 膠 中 向 下 移 動(dòng) 的速 度 不 同 。l 物 質(zhì) 進(jìn) 入 凝 膠 柱 之 后 有 兩 種 運(yùn) 動(dòng) 方 式 ： 垂 直 向 下 移 動(dòng) 和 無 定 向的 擴(kuò) 散 運(yùn) 動(dòng) 。 大 分 子 物 質(zhì) 直 徑 大 無 法 進(jìn) 入 凝 膠 顆 粒 內(nèi) ， 只 能 分布 于 顆 粒 間 隙 中 向 下 移 動(dòng) 快 ， 而 小 分 子 物 質(zhì) 可 擴(kuò) 散 到 凝 膠 顆 粒內(nèi) ， 因 此 向 下 移 動(dòng) 慢 。l 凝 膠 物 質(zhì) ： 馬 鈴 薯 淀 粉 凝 膠 、 瓊 脂 、

17、 瓊 脂 糖 凝 膠 、 聚 丙 烯酰 胺 凝 膠 、 葡 聚 糖 凝 膠 。 電 泳 技 術(shù)一 .電 泳 的 概 念二 .電 泳 技 術(shù) 分 類三 .電 泳 技 術(shù) 基 本 原 理四 .幾 種 常 見 電 泳 方 法 的 比 較五 .聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 盤 狀 電 泳 原 理 一 .電 泳 的 概 念l 帶 電 質(zhì) 點(diǎn) 在 電 場 中 移 動(dòng) 的 現(xiàn) 象 。 二 .電 泳 技 術(shù) 分 類 淀粉凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 凝膠支持物區(qū)帶電泳 紙電泳 醋酸纖維薄膜電泳 薄層電泳 非凝膠支持物電泳 用支持物區(qū)帶電泳 顯 微 電 泳 等 電 聚 焦 電 泳 等 速 電 泳 不

18、用 支 持 物 電 泳 是否用支持物 三 .電 泳 技 術(shù) 基 本 原 理1.基 本 原 理 不 同 的 帶 電 顆 粒 在 同 一 電 場 中 泳 動(dòng) 速 度 ， 主 要 與 其 所帶 凈 電 荷 量 ， 分 子 量 及 分 子 形 狀 有 關(guān) 。 pH pI 分 子 帶 負(fù) 電 荷 ,在 電 場 中 向 正 極 移 動(dòng) ; pH 蛋 Glyl m cl clm蛋 蛋 m Gly Glyl 凝 膠 中 Cl 為 快 離 子 ， Gly 為 慢 離 子 ，蛋 白 質(zhì) 樣 品 被 夾 在 中 間 。 緩 沖 液樣 品濃 縮 膠分 離 膠 緩 沖 液 成 分 及 pH的 不 連 續(xù) 性 導(dǎo) 致 蛋

19、 白 質(zhì) 樣 品 濃 縮 效應(yīng) 示 意 圖l 快 離 子l 慢 離 子l 蛋 白 質(zhì)樣 品 l E： 每 厘 米 的 電 壓 降 E I(電 流 強(qiáng) 度 )/ (電 導(dǎo) 率 )l E與 電 泳 速 度 成 正 比l 電 泳 開 始 后 ， 由 于 快 離 子 泳 動(dòng)率 最 大 ， 在 快 離 子 后 面 形 成 一個(gè) 離 子 濃 度 低 的 低 電 導(dǎo) 區(qū) ， 產(chǎn)生 較 高 的 電 位 梯 度 ， 使 蛋 白 質(zhì)和 慢 離 子 加 速 移 動(dòng) ， 蛋 白 質(zhì) 樣品 被 進(jìn) 一 步 濃 縮 。電 位 梯 度 的 不 連 續(xù) 性 l E： 每 厘 米 的 電 壓 降 E I(電 流 強(qiáng) 度 )/

20、(電 導(dǎo) 率 )l E與 電 泳 速 度 成 正 比l 電 泳 開 始 后 ， 由 于 快 離 子 泳 動(dòng)率 最 大 ， 在 快 離 子 后 面 形 成 一個(gè) 離 子 濃 度 低 的 低 電 導(dǎo) 區(qū) ， 產(chǎn)生 較 高 的 電 位 梯 度 ， 使 蛋 白 質(zhì)和 慢 離 子 加 速 移 動(dòng) ， 蛋 白 質(zhì) 樣品 被 進(jìn) 一 步 濃 縮 。電 位 梯 度 的 不 連 續(xù) 性 A. 樣 品 的 濃 縮 效 應(yīng)四 個(gè) 不 連 續(xù) 性 造 成 樣 品 濃 縮 效 應(yīng) 原理 包 括 ：l 緩 沖 液 成 分 及 pH的 不 連 續(xù) 性l 電 位 梯 度 的 不 連 續(xù) 性 緩 沖 液濃 縮 膠樣 品分 離

21、膠 A. 樣 品 的 濃 縮 效 應(yīng)四 個(gè) 不 連 續(xù) 性 造 成 樣 品 濃 縮 效 應(yīng) 原理 包 括 ：l 凝 膠 層 的 不 連 續(xù) 性 ： 樣 品 進(jìn) 入 濃 縮 膠 有 一 個(gè) 堆 積 濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動(dòng) ， 從 濃 縮 膠 進(jìn) 入 分 離 膠 ， 速度 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液樣 品濃 縮 膠分 離 膠 A. 樣 品 的 濃 縮 效 應(yīng)四 個(gè) 不 連 續(xù) 性 造 成 樣 品 濃 縮 效 應(yīng) 原理 包 括 ：l 凝 膠 層 的 不 連 續(xù) 性 ： 樣 品 進(jìn) 入 濃 縮 膠 有 一 個(gè) 堆 積

22、濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動(dòng) ， 從 濃 縮 膠 進(jìn) 入 分 離 膠 ， 速度 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液樣 品濃 縮 膠分 離 膠 A. 樣 品 的 濃 縮 效 應(yīng)四 個(gè) 不 連 續(xù) 性 造 成 樣 品 濃 縮 效 應(yīng) 原理 包 括 ：l 凝 膠 層 的 不 連 續(xù) 性 ： 樣 品 進(jìn) 入 濃 縮 膠 有 一 個(gè) 堆 積 濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動(dòng) ， 從 濃 縮 膠 進(jìn) 入 分 離 膠 ， 速度 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液濃 縮 膠分

23、 離 膠 A. 樣 品 的 濃 縮 效 應(yīng)四 個(gè) 不 連 續(xù) 性 造 成 樣 品 濃 縮 效 應(yīng) 原理 包 括 ：l 凝 膠 層 的 不 連 續(xù) 性 ： 樣 品 進(jìn) 入 濃 縮 膠 有 一 個(gè) 堆 積 濃 縮效 應(yīng) (緩 沖 液 pH8.3) 蛋 白 質(zhì) 從 “ ” 極 向 “ ” 極 移動(dòng) ， 從 濃 縮 膠 進(jìn) 入 分 離 膠 ， 速度 變 慢 ， 堆 積 濃 縮 。 緩 沖 液濃 縮 膠分 離 膠 B.電 荷 效 應(yīng)l 蛋 白 質(zhì) 樣 品 進(jìn) 入 分 離 膠 后 pH增 大 (pH 8.9)， Gly 解 離 度 增大 ， 不 存 在 快 、 慢 離 子 之 分 ，蛋 白 質(zhì) 樣 品 在

24、 均 一 電 場 強(qiáng) 度 和pH條 件 下 泳 動(dòng) 。l 由 于 各 種 蛋 白 質(zhì) pI不 同 ， 所 載有 效 電 荷 不 同 ， 因 此 質(zhì) 點(diǎn) 的 有效 遷 移 率 不 同 ， 形 成 不 同 區(qū) 帶 。 緩 沖 液濃 縮 膠分 離 膠 C.分 子 篩 效 應(yīng)l 分 離 膠 的 孔 徑 小 ， 各 分 子由 于 大 小 和 形 狀 不 同 ， 所受 阻 力 不 同 ， 表 現(xiàn) 出 不 同的 泳 動(dòng) 速 度 ， 即 分 子 篩 作用 。 分 子 量 小 ， 形 狀 為 球形 的 泳 動(dòng) 速 度 最 快 。 緩 沖 液濃 縮 膠分 離 膠 實(shí) 驗(yàn) 一 氨 基 酸 的 分 離 與 鑒 定 濾

25、 紙 層 析 法 一 、 實(shí) 驗(yàn) 目 的1.通 過 氨 基 酸 的 分 離 ， 學(xué) 習(xí) 紙 層 析 法 的 基 本 原 理 及操 作 方 法2.掌 握 氨 基 酸 紙 上 層 層 析 法 的 操 作 技 術(shù) （ 點(diǎn) 樣 、 平衡 、 展 層 、 顯 色 、 鑒 定 ） . 二 、 實(shí) 驗(yàn) 原 理1.是 分 配 層 析 的 一 種 。 在 紙 上 水 被 吸 附 在 纖 維 素 的 纖 維 之 間 形 成 固 定相 。 當(dāng) 有 機(jī) 相 沿 紙 流 動(dòng) 經(jīng) 過 層 析 點(diǎn) 時(shí) ， 層 析 點(diǎn) 上 溶 質(zhì) 就 在 水 相 和有 機(jī) 相 之 間 進(jìn) 行 分 配 ， 溶 質(zhì) 中 各 組 分 的 分 配

26、系 數(shù) 不 同 ， 移 動(dòng) 速 率也 不 同 ， 因 而 可 以 彼 此 分 開 。2.氨 基 酸 與 茚 三 酮 的 顯 色 反 應(yīng) 。3.物 質(zhì) 被 分 離 后 在 紙 層 析 圖 譜 上 的 位 置 是 用 Rf值 來 表 示 的 。 在 一 定 的條 件 下 某 種 物 質(zhì) 的 Rf值 是 常 數(shù) 。 R f 原 點(diǎn) 到 溶 劑 前 沿 的 距 離原 點(diǎn) 到 層 析 點(diǎn) 中 心 的 距 離 4. Rf值 的 大 小 與 物 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 、 性 質(zhì) 、 溶 劑 系 統(tǒng) 、 PH層 析 濾 紙 的 質(zhì)量 和 層 析 溫 度 等 因 素 有 關(guān) 。5.上 層 層 析 、 下 層 層 析

27、、 單 向 層 析 、 雙 向 層 析 。 三 、 儀 器 、 材 料 和 試 劑實(shí) 驗(yàn) 儀 器1 層 析 缸 、 培 養(yǎng) 皿 、 小 燒 杯 、 長 頸 漏 斗2 毛 細(xì) 管 、 吹 風(fēng) 機(jī) 、 電 熱 鼓 風(fēng) 干 燥 箱3 層 析 濾 紙 、 手 套 、 透 明 膠 帶 或 針 線實(shí) 驗(yàn) 材 料 和 試 劑1 氨 基 酸 溶 液 分 別 配 制 0.5%的 Lys、 Alu、 Ile、 Met溶 液 及 它 們 的混 合 液 （ 各 組 份 濃 度 均 為 0.5%） 。2 顯 色 劑 0.1%水 合 茚 三 酮 丙 酮 溶 液 。3 擴(kuò) 展 劑 （ 展 層 劑 ） 酸 溶 劑 系 統(tǒng) ：

28、 正 丁 醇 :80%甲 酸 :水 15:3:2（ 體 積 比 ） ， 平 衡 溶 劑與 擴(kuò) 展 劑 相 同 。 每 組 配 制 30ml 堿 溶 劑 系 統(tǒng) ： 正 丁 醇 :12%氨 水 :95%乙 醇 13:3:3（ 體 積 比 ） ， 平 衡 溶 劑 為 12%氨 水 。 四 、 操 作 步 驟 與 方 法 溶 劑 前 沿層 析 點(diǎn) 原 點(diǎn) 溶 劑 前 沿亮苯 丙纈脯賴 l 1 將 盛 有 擴(kuò) 展 劑 10ml的 小 燒 杯 和 培 養(yǎng) 皿 置 于 密 閉 的 層 析 缸 中 。l 2 戴 手 套 取 層 析 濾 紙 一 張 作 標(biāo) 記 。l 3。 點(diǎn) 樣 ： 干 后 重 復(fù) 點(diǎn) 一

29、次 ， 直 徑 最 大 不 超 過 3mm。 縫 成 筒 狀 ， 兩 邊 不 能接 觸 。 點(diǎn) 樣 面 朝 外 ， 點(diǎn) 樣 端 朝 下 ， 蓋 上 層 析 缸 蓋 ， 平 衡 約 2030分 鐘 。l 4.展 層 用 長 頸 漏 斗 ， 擴(kuò) 展 劑 的 液 面 需 低 于 點(diǎn) 樣 線 1cm。 上 沿 約 1厘 米 時(shí) ，取 出 濾 紙 ， 用 鉛 筆 標(biāo) 出 溶 劑 前 沿 界 線 ， 干 燥 。l 5 顯 色 用 0.1%茚 三 酮 丙 酮 溶 液 均 勻 浸 透 ， 烘 箱 （ 65 ） 5分 鐘 或 用 熱風(fēng) 吹 干 。 脯 氨 酸 、 羥 脯 氨 酸 產(chǎn) 生 黃 色 物 質(zhì) 外 ，

30、所 有 氨 基 酸 及 一 切 蛋白 質(zhì) 都 能 和 茚 三 酮 產(chǎn) 生 蘭 紫 色 物 質(zhì) 。 五 、 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 與 討 論 六 、 注 意 事 項(xiàng)1 切 勿 用 手 直 接 接 觸 濾 紙 和 顯 色 劑 。2. 點(diǎn) 樣 過 程 中 必 須 在 第 一 滴 樣 品 干 后 再 點(diǎn) 第 二 滴 。3 使 用 的 溶 劑 系 統(tǒng) 需 新 鮮 配 制 ， 并 要 搖 勻 。 七 、 思 考 題 ：l 1 做 好 本 實(shí) 驗(yàn) 的 關(guān) 鍵 是 什 么 ？l 2 實(shí) 驗(yàn) 操 作 過 程 ， 為 何 不 能 用 手 接 觸 濾 紙 ？l 3 影 響 Rf值 的 因 素 有 哪 些 ？ 實(shí) 驗(yàn) 二

31、血 清 蛋 白 質(zhì) 醋 酸 纖 維 薄 膜 電 泳 l 實(shí) 驗(yàn) 原 理l 實(shí) 驗(yàn) 材 料 與 儀 器l 實(shí) 驗(yàn) 試 劑l 實(shí) 驗(yàn) 步 驟 實(shí) 驗(yàn) 原 理 醋 酸 纖 維 薄 膜 電 泳 (CAME)是 以 醋 酸 纖 維 薄 膜 (CAM)作 支 持 物 的 一 種 區(qū) 帶 電 泳 技 術(shù) 。 醋 酸 纖 維 素 薄 膜 是 纖 維 素 的 羥 基 乙 酰 化 形 成 的 纖 維 素 醋 酸 酯 。 將 它 溶 于 有 機(jī) 溶 劑 （ 如 ： 丙 酮 ， 氯 仿 、 氯 乙 烯 、 乙 酸 乙 酯 等 ） 后 ， 涂 抹 成 均 勻 的 薄 膜 則 成 為 醋 酸 纖 維 素 薄 膜 。 該

32、膜 具 有 均 一 的 泡 沫 狀 結(jié) 構(gòu) ， 滲 透 性 強(qiáng) ， 對 分 子 移 動(dòng) 阻 力 小 ， 厚 度 為 120m 。 本 實(shí) 驗(yàn) 以 醋 酸 纖 維 素 薄 膜 為 電 泳 支 持 物 ， 分 離 人 血 清 蛋 白 。 血 清 蛋 白 中含 有 清 蛋 白 、 1球 蛋 白 、 2球 蛋 白 、 球 蛋 白 、 球 蛋 白 和 各 種 脂 蛋 白等 。 各 種 蛋 白 質(zhì) 由 于 氨 基 酸 組 分 、 立 體 構(gòu) 象 、 分 子 量 、 等 電 點(diǎn) 及 形 狀 不 同 ，在 電 場 中 的 遷 移 速 度 不 同 。 分 子 量 小 、 等 電 點(diǎn) 低 的 ， 在 相 同 堿

33、性 PH緩 沖 體 系中 ， 帶 負(fù) 電 荷 多 的 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 在 電 場 中 遷 移 速 度 快 。 例 如 人 血 清 蛋 白 在 PH8.6的 緩 沖 體 系 中 電 泳 ， 染 色 后 可 顯 示 5條 區(qū) 帶 。 清 蛋 白 泳 動(dòng) 最 快 ， 其 余 依 次 是 球 蛋 白 。 實(shí) 驗(yàn) 材 料 與 儀 器（ 一 ） 、 材 料 ： 人 血 清（ 二 ） 、 儀 器 醋 酸 纖 維 薄 膜 (8X2mm)； 點(diǎn) 樣 器 ； 染 色 皿 ， 漂 洗 器 ， 鑷 子 ； 玻 璃 板 ； 常 壓 電 泳 儀 ； 直 流 電 源 整 流 器 ； 水 平 電 泳 槽 ； 粗 濾 紙

34、； 直 尺 和 鉛 筆 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 巴 比 妥 緩 沖 液 (pH8.6 I=0.06)； 氨 基 黑 10B染 色 液 ； 漂 洗 液 ；95 乙 醇 45ml、 冰 醋 酸 5ml； 蒸 餾 水 50ml； 洗 脫 液 0.4molLNaOH； 透 明 液 ； 無 水 乙 醇 ； 冰 醋 酸 7： 3 實(shí) 驗(yàn) 步 驟1 浸 泡 ： 用 鑷 子 取 醋 酸 纖 維 薄 膜 放 在 緩 沖 液 中 浸 泡 20分 鐘 。2 點(diǎn) 樣 ： 把 膜 條 從 緩 沖 液 中 取 出 ， 夾 在 兩 層 粗 濾 紙 內(nèi) 吸 干 多 余 的 液 體 ， 然 后 鋪 在 玻 璃 板 上 (無 光 澤 面

35、 朝 上 )， 將 點(diǎn) 樣 器 在 血 清 中 沾 一 下 （ 量 薄 薄 一 層 為 好 ） ， 再 在 膜 條 一 端 2-3厘 米 處 輕 輕 水 平 地 落 下 并 隨 時(shí) 提 起 ， 這 樣 即 在 膜 條 上 點(diǎn) 上 了 細(xì) 條 狀 的 血 清 樣 品 。 3 電 泳 ： 在 電 泳 槽 內(nèi) 加 入 緩 沖 液 ， 使 兩 個(gè) 電 極 槽 內(nèi) 的 液 面 等 高 ， 將 膜 條 平 懸 于 電 泳 槽 支 架 的 濾 紙 橋 上 。 膜 條 點(diǎn) 樣 的 一 端 放 在 負(fù) 極 上 。 通 電 ， 電 流 強(qiáng) 度 每 條 膜 1mA(注 意 強(qiáng) 度 ),電 泳 時(shí) 間 約 為 50分

36、 鐘 。4 染 色 ： 電 泳 完 畢 后 將 膜 條 取 下 并 放 在 染 色 液 中 浸 泡 5分 鐘 。5 漂 洗 ： 將 膜 條 從 染 色 液 中 取 出 后 移 置 到 漂 洗 液 申 漂 洗 數(shù) 次 至 無 蛋 白 區(qū) 底 色 脫 凈 為 止 ， 可 得 到 色 帶 清 晰 的 電 泳 圖 譜 。6 透 明 ： 將 脫 色 后 干 燥 的 電 泳 圖 譜 膜 條 放 入 透 明 液 中 浸 泡 2 3分 鐘 后 取 出 平 鋪 在 玻 璃 板 上 ,用 一 直 徑 0.5cm 的 玻 璃 棒 將 其 間 的 氣 泡 趕 出 ,兩 者 之 間 不 能 有 泡 。 干 燥 后 此

37、透 明 薄 膜 ,區(qū) 帶 著 色 清 晰 ,可 用 于 光 吸 收 掃 描 ,長 期 保 存 不 褪 色 。 思 考 題 ：l .為 什 么 將 薄 膜 的 點(diǎn) 樣 端 放 在 濾 紙 橋 的 負(fù) 極端 ？l .用 乙 酸 纖 維 素 薄 膜 作 為 電 泳 支 持 物 有 何 優(yōu)點(diǎn) ？ 實(shí) 驗(yàn) 三 蛋 白 質(zhì) 的 性 質(zhì) 實(shí) 驗(yàn) 蛋 白 質(zhì) 及 氨 基 酸 的 呈 色 反 應(yīng) 一 、 實(shí) 驗(yàn) 目 的l （ 1） 了 解 蛋 白 質(zhì) 和 某 些 氨 基 酸 的 呈 色 反 應(yīng)原 理 。l （ 2） 學(xué) 習(xí) 幾 種 常 用 的 鑒 定 蛋 白 質(zhì) 和 氨 基 酸的 方 法 。 二 、 實(shí) 驗(yàn) 原

38、 理l 雙 縮 脲 反 應(yīng)l 尿 素 加 熱 至 180 左 右 ， 生 成 雙 縮 脲 并 放 出 一 分 子 氨 。 雙縮 脲 在 堿 性 環(huán) 境 中 能 與 Cu2+結(jié) 合 生 成 紫 紅 色 化 合 物 ， 此 反 應(yīng)稱 為 雙 縮 脲 反 應(yīng) 。 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 有 肽 鍵 ， 其 結(jié) 構(gòu) 與 雙 縮 脲 相 似 ，也 能 發(fā) 生 此 反 應(yīng) 。 可 用 于 蛋 白 質(zhì) 的 定 性 或 定 量 測 定 。l 雙 縮 脲 反 應(yīng) 不 僅 為 含 有 兩 個(gè) 以 上 肽 鍵 的 物 質(zhì) 所 有 。 含 有 一個(gè) 肽 鍵 和 一 個(gè) CSNH2， CH2NH2， CRHNH2， C

39、H2NH2CHNH2CH2OH或 CHOHCH2NH2等 基 團(tuán) 的 物 質(zhì) 也 有 此 反 應(yīng) 。 NH3干 擾 此 反 應(yīng) ， 因 為 NH-3與Cu-2+可 生 成 暗 藍(lán) 色 的 絡(luò) 離 子 Cu（ NH3） 42+。 因 此 ， 一 切 蛋白 質(zhì) 或 二 肽 以 上 的 多 肽 都 有 雙 縮 脲 反 應(yīng) ， 但 有 雙 縮 脲 反 應(yīng) 的 物質(zhì) 不 一 定 都 是 蛋 白 質(zhì) 或 多 肽 。 茚 三 酮 反 應(yīng)l 除 脯 氨 酸 、 羥 脯 氨 酸 和 茚 三 酮 反 應(yīng) 產(chǎn) 生 黃 色 物 質(zhì) 外 ， 所有 氨 基 酸 及 一 切 蛋 白 質(zhì) 都 能 和 茚 三 酮 反 應(yīng) 生

40、成 藍(lán) 紫 色 物質(zhì) 。 該 反 應(yīng) 十 分 靈 敏 ， 1 1 500 000濃 度 的 氨 基 酸 水 溶 液 即能 給 出 反 應(yīng) ， 是 一 種 常 用 的 氨 基 酸 定 量 測 定 方 法 。l 茚 三 酮 反 應(yīng) 分 為 兩 步 ， 第 一 步 是 氨 基 酸 被 氧 化 形 成 CO2、NH3和 醛 ， 水 合 茚 三 酮 被 還 原 成 還 原 型 茚 三 酮 ； 第 二 步 是 所形 成 的 還 原 型 茚 三 酮 同 另 一 個(gè) 水 合 茚 三 酮 分 子 和 氨 縮 合 生 成有 色 物 質(zhì) 。l 此 反 應(yīng) 的 適 宜 pH為 57， 同 一 濃 度 的 蛋 白 質(zhì)

41、或 氨 基 酸 在不 同 pH條 件 下 的 顏 色 深 淺 不 同 ， 酸 度 過 大 時(shí) 甚 至 不 顯 色 。 黃 色 反 應(yīng)l 含 有 苯 環(huán) 結(jié) 構(gòu) 的 氨 基 酸 ， 如 酪 氨 酸 和 色 氨酸 ， 遇 硝 酸 后 ， 可 被 硝 化 成 黃 色 物 質(zhì) ， 該 化 合物 在 堿 性 溶 液 中 進(jìn) 一 步 形 成 橙 黃 色 的 硝 醌 酸 鈉 。l 多 數(shù) 蛋 白 質(zhì) 分 子 含 有 帶 苯 環(huán) 的 氨 基 酸 ， 所以 有 黃 色 反 應(yīng) ， 苯 丙 氨 酸 不 易 硝 化 ， 需 加 入 少量 濃 硫 酸 才 有 黃 色 反 應(yīng) 。 乙 醛 酸 反 應(yīng)l 在 濃 硫 酸

42、存 在 下 ， 色 氨 酸 與 乙 醛 酸 反 應(yīng) 生成 紫 色 物 質(zhì) ， 反 應(yīng) 機(jī) 理 尚 不 清 楚 ， 可 能 是 一 分子 乙 醛 酸 與 兩 分 子 色 氨 酸 脫 水 縮 合 形 成 與 靛 藍(lán)相 似 的 物 質(zhì) 。 含 有 色 氨 酸 的 蛋 白 質(zhì) 也 有 此 反 應(yīng) 。 三 、 儀 器 、 材 料 和 試 劑 實(shí) 驗(yàn) 儀 器 試 管 ； 試 管 架 ； 漏 斗 ； 鐵 架 臺 ； 滴 管 ； 試 劑 瓶 ；水 浴 鍋 。 實(shí) 驗(yàn) 材 料 和 試 劑 尿 素 ； 10%氫 氧 化 鈉 溶 液 ； 1%硫 酸 銅 溶液 ； 2%卵 清 蛋 白 溶 液 ； 0.5%甘 氨 酸

43、溶 液 ；0.1%茚 三 酮 水 溶 液 ； 大 豆 提 取 液 ； 頭 發(fā) ； 指甲 ； 0.5%苯 酚 溶 液 ； 濃 硝 酸 ； 0.3%色 氨 酸 溶液 ； 0.3%酪 氨 酸 溶 液 ； 冰 醋 酸 、 濃 硫 酸 。 四 、 操 作 步 驟 與 方 法 取 少 量 尿 素 結(jié) 晶 ， 放 在 干 燥 試 管 中 。 用 微 火 加 熱 使尿 素 熔 化 。 熔 化 的 尿 素 開 始 硬 化 時(shí) ， 停 止 加 熱 ， 尿 素 放 出 氨 ，形 成 雙 縮 脲 。 冷 后 ， 加 10%氫 氧 化 鈉 溶 液 約 1ml， 振 蕩 混 勻 ，再 加 1%硫 酸 銅 溶 液 1滴 ，

44、 再 振 蕩 。 觀 察 出 現(xiàn) 的 粉 紅 顏 色 。 要避 免 添 加 過 量 硫 酸 銅 ， 否 則 ， 生 成 的 藍(lán) 色 氫 氧 化 銅 能 掩 蓋 粉紅 色 。 向 另 一 試 管 加 卵 清 蛋 白 溶 液 約 1ml和 10%氫 氧 化 鈉 溶 液2ml， 搖 勻 ， 再 加 1%硫 酸 銅 溶 液 2滴 ， 隨 加 隨 搖 。 觀 察 紫 玫 瑰色 的 出 現(xiàn) 。雙 縮 脲 反 應(yīng) 實(shí) 驗(yàn) 操 作 茚 三 酮 反 應(yīng) 實(shí) 驗(yàn) 操 作l 取 2支 試 管 分 別 加 入 蛋 白 質(zhì) 溶 液 和 甘 氨 酸 溶液 1ml， 再 各 加 0.5ml0.1%茚 三 酮 水 溶 液 ，

45、 混 勻 ，在 沸 水 浴 中 加 熱 12分 鐘 ， 觀 察 顏 色 由 粉 色 變紫 紅 色 再 變 藍(lán) 。l 在 一 小 塊 濾 紙 上 滴 一 滴 0.5%甘 氨 酸 溶 液 ， 風(fēng)干 后 ， 再 在 原 處 滴 一 滴 0.1%茚 三 酮 乙 醇 溶 液 ，在 微 火 旁 烘 干 顯 色 ， 觀 察 紫 紅 色 斑 點(diǎn) 的 出 現(xiàn) 。 黃 色 反 應(yīng) 實(shí) 驗(yàn) 操 作l 向 7個(gè) 試 管 中 分 別 按 下 表 加 入 試 劑 ， 觀 察 各 管 出現(xiàn) 的 現(xiàn) 象 ， 有 的 試 管 反 應(yīng) 慢 可 略 放 置 或 用 微 火加 熱 。 待 各 管 出 現(xiàn) 黃 色 后 ， 于 室 溫

46、下 逐 滴 加 入10%氫 氧 化 鈉 溶 液 至 堿 性 ， 觀 察 顏 色 變 化 。管 號 1 2 3 4 5 6 7材 料（ 滴 ） 雞 蛋 清溶 液4 大 豆提 取 液4 指 甲少 許 頭 發(fā)少 許 0.5%苯 酚4 0.3%色 氨 酸4 0.3%酪 氨 酸4 濃 硝 酸 /（ 滴 ） 2 4 40 40 4 4 4現(xiàn) 象 乙 醛 酸 反 應(yīng) 實(shí) 驗(yàn) 操 作l 取 3支 試 管 。 編 號 。 分 別 按 上 表 加 入 蛋 白 質(zhì) 溶液 、 色 氨 酸 溶 液 和 水 ， 然 后 各 加 入 冰 醋 酸 2毫 升 ，混 勻 后 傾 斜 試 管 ， 沿 管 壁 分 別 緩 緩 加 入

47、 濃 硫 酸 約 1毫 升 ， 靜 置 。 觀 察 各 管 液 面 間 紫 色 環(huán) 的 出 現(xiàn) 。 若 不明 顯 ， 可 于 水 浴 中 微 熱 。試 劑管 號 水滴 0.03%色 氨酸 溶 液（ 滴 ） 蛋 白 質(zhì) 溶液（ 滴 ） 冰 醋 酸（ ml） 濃 硫 酸（ ml） 現(xiàn) 象1 - - 5 2 1 2 4 1 - 2 13 5 - - 2 1 五 、 思 考 題 ：l 1.茚 三 酮 反 應(yīng) 的 陽 性 結(jié) 果 是 否 經(jīng) 常 是 同 一 色 調(diào) ？并 說 明 原 因 。l 2.你 能 區(qū) 分 蛋 白 質(zhì) 茚 三 酮 反 應(yīng) 及 其 他 氨 基 化 合物 茚 三 酮 反 應(yīng) 的 結(jié) 果

48、 嗎 ？ 試 解 釋 之 。l 3.能 否 利 用 茚 三 酮 反 應(yīng) 可 靠 地 鑒 定 蛋 白 質(zhì) 的 存在 ？l 4.哪 些 芳 香 基 因 （ 蛋 白 質(zhì) 中 的 、 非 蛋 白 質(zhì) 中 的 ）可 以 與 濃 硝 酸 作 用 呈 現(xiàn) 黃 色 反 應(yīng) 的 陽 性 結(jié) 果 ？ 實(shí) 驗(yàn) 四 蛋 白 質(zhì) 的 變 性 、 沉 淀 反 應(yīng) 一 、 實(shí) 驗(yàn) 目 的l （ 1） 加 深 對 蛋 白 質(zhì) 膠 體 溶 液 穩(wěn) 定 因 素 的 認(rèn)識 。l （ 2） 了 解 沉 淀 蛋 白 質(zhì) 的 幾 種 方 法 及 其 實(shí) 用意 義 。l （ 3） 了 解 蛋 白 質(zhì) 變 性 與 沉 淀 的 關(guān) 系 。 二

49、 、 實(shí) 驗(yàn) 原 理l 在 水 溶 液 中 的 蛋 白 質(zhì) 分 子 由 于 表 面 生 成 水 化層 和 雙 電 層 而 成 為 穩(wěn) 定 的 親 水 膠 體 顆 粒 ， 在 一 定的 理 化 因 素 影 響 下 ， 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 可 因 失 去 電 荷 和脫 水 而 沉 淀 。 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀 反 應(yīng) 可 分 為 兩 類 。l（ 1） 可 逆 的 沉 淀 的 反 應(yīng) 此 時(shí) 蛋 白 質(zhì) 分 子 的 結(jié) 構(gòu)尚 未 發(fā) 生 顯 著 變 化 ， 除 去 引 起 沉 淀 的 因 素 后 ， 蛋白 質(zhì) 的 沉 淀 仍 能 溶 解 于 原 來 的 溶 劑 中 ， 并 保 持 其天 然 性 質(zhì)

50、 而 不 變 性 。 如 大 多 數(shù) 蛋 白 質(zhì) 的 鹽 析 作 用或 在 低 溫 下 用 乙 醇 （ 或 丙 酮 ） 短 時(shí) 間 作 用 于 蛋 白質(zhì) 。 提 純 蛋 白 質(zhì) 時(shí) ， 常 利 用 此 類 反 應(yīng) 。 l （ 2） 不 可 逆 沉 淀 反 應(yīng) 此 時(shí) 蛋 白 質(zhì) 分 子 內(nèi) 部 結(jié)構(gòu) 發(fā) 生 重 大 改 變 ， 蛋 白 質(zhì) 常 變 性 而 沉 淀 ， 不 再 溶于 原 來 溶 劑 中 。 加 熱 引 起 的 蛋 白 質(zhì) 沉 淀 與 凝 固 ，蛋 白 質(zhì) 與 重 金 屬 離 子 或 某 些 有 機(jī) 酸 的 反 應(yīng) 都 屬 于此 類 。l 蛋 白 質(zhì) 變 性 后 ， 有 時(shí) 由 于

51、 維 持 溶 液 穩(wěn) 定 的 條件 仍 然 存 在 （ 如 電 荷 ） ， 并 不 析 出 。 因 此 變 性 蛋白 質(zhì) 并 不 一 定 都 表 現(xiàn) 為 沉 淀 ， 而 沉 淀 的 蛋 白 質(zhì) 也未 必 都 已 變 性 。 三 、 儀 器 、 材 料 和 試 劑 實(shí) 驗(yàn) 材 料 和 試 劑 0.2%雞 蛋 清 溶 液 ； pH4.7 醋 酸 -醋酸 鈉 的 緩 沖 溶 液 ； 3%硝 酸 銀 溶 液 ； 5%三氯 乙 酸 溶 液 ； 95%乙 醇 ； 飽 和 硫 酸 銨 溶液 ； 硫 酸 銨 結(jié) 晶 粉 末 ； 0.1 molL-1鹽酸 溶 液 ； 0.1 molL-1氫 氧 化 鈉 溶 液

52、；0.05 molL-1碳 酸 鈉 溶 液 ； 0.1 molL-1醋 酸 溶 液 ； 甲 基 紅 溶 液 ； 2%氯 化 鋇 溶 液 ；10%NaOH； 飽 和 的 NaCl； 10%醋 酸 。 四 、 操 作 步 驟 與 方 法 1 鹽 析 ： 加 5%卵 清 蛋 白 溶 液 5 ml于 試 管 中 ， 再 加 等 量 的 飽 和 硫 酸 銨溶 液 ， 混 勻 后 靜 置 數(shù) 分 鐘 則 析 出 球 蛋 白 的 沉 淀 。 倒 出 少 量 混 濁 沉 淀 ， 加少 量 水 ， 觀 察 是 否 溶 解 ， 為 什 么 ？ 將 管 中 內(nèi) 容 物 過 濾 ， 向 濾 液 中 添 加 硫酸 銨

53、粉 末 到 不 再 溶 解 為 止 ， 此 時(shí) 析 出 的 沉 淀 為 清 蛋 白 。取 出 部 分 清 蛋 白 ， 加 少 量 蒸 餾 水 ， 觀 察 沉 淀 的 再 溶 解 。2 重 金 屬 離 子 沉 淀 蛋 白 質(zhì) ： 重 金 屬 離 子 與 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 成 不 溶 于 水 的復(fù) 合 物 。 取 1支 試 管 ， 加 入 蛋 白 質(zhì) 溶 液 2 ml， 再 加 3%硝 酸 銀 溶 液 12滴 ， 振蕩 試 管 ， 有 沉 淀 產(chǎn) 生 。 放 置 片 刻 ， 傾 去 上 清 液 ， 向 沉 淀 中 加 入 少 量 的 水 ，沉 淀 是 否 溶 解 ？ 為 什 么 ？3 某 些 有

54、 機(jī) 酸 沉 淀 蛋 白 質(zhì) ： 取 1支 試 管 ， 加 入 蛋 白 質(zhì) 溶 液 2 ml， 再 加1 ml5%三 氯 乙 酸 溶 液 ， 振 蕩 試 管 ， 觀 察 沉 淀 的 生 成 。 放 置 片 刻 ， 傾 出 上清 液 ， 向 沉 淀 中 加 入 少 量 水 ， 觀 察 沉 淀 是 否 溶 解 。 l 4 加 熱 沉 淀 蛋 白 質(zhì) ： 取 5支 試 管 ， 編 號 。 依 下 表 順 序 加 入 試劑 ： 將 各 管 混 勻 ， 觀 察 記 錄 各 管 情 況 ， 然 后 ， 放 沸 水 浴 中 加熱 10min， 注 意 觀 察 各 管 的 沉 淀 情 況 ， 最 后 將 第

55、3、 4、 5號 管分 別 用 10%NaOH或 10%醋 酸 中 和 ， 觀 察 并 解 釋 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 。試 劑管 號 蛋 清 蛋 白 質(zhì)（ 滴 ） 0.1mol/L醋 酸（ 滴 ） 10%醋 酸（ 滴 ） 飽 和 的NaCl（ 滴 ） 10%NaOH(滴 ） 蒸 餾 水（ 滴 ）1 10 - - - - 72 10 5 - - - 53 10 - 5 - - 54 10 - 5 2 - -5 10 - - - 2 5 5 乙 醇 引 起 的 變 性 與 沉 淀 ： 取 3支 試 管 ， 編 號 。 依 下 表 順 序 加入 試 劑 ： 振 搖 混 勻 后 ， 觀 察 各 管 有 何

56、變 化 。 放 置 片 刻 ， 向 各 管 內(nèi)加 水 8 ml， 然 后 在 第 2、 3號 管 中 各 加 一 滴 甲 基 紅 ， 再 分 別 用0.1 molL-1醋 酸 溶 液 及 0.05 molL-1碳 酸 鈉 溶 液 中 和 之 。 觀 察各 管 顏 色 的 變 化 和 沉 淀 的 生 成 。 每 管 再 加 0.1 molL-1鹽 酸 溶液 數(shù) 滴 ， 觀 察 沉 淀 的 再 溶 解 。 解 釋 各 管 發(fā) 生 的 全 部 現(xiàn) 象 。 試 劑 （ ml）管 號 5%卵 清蛋 白 溶 液 0.1 molL-1氫 氧 化 鈉溶 液 0.1 molL-1鹽 酸 溶 液 95%乙 醇 p

57、H4.7緩 沖 溶 液123 111 1 1 111 1 五 、 思 考 題 ：l 1. 雞 蛋 清 為 何 可 做 鉛 、 汞 中 毒 的 解 素 劑 ？l 2 氯 化 汞 為 何 能 做 為 殺 菌 劑 ？ 實(shí) 驗(yàn) 五 凝 膠 過 濾 法 使 蛋 白 質(zhì) 脫 鹽 一 、 實(shí) 驗(yàn) 目 的l 學(xué) 習(xí) 凝 膠 過 濾 法 分 離 純 化 物 質(zhì) 的 原 理與 操 作 技 術(shù) 。 二 、 實(shí) 驗(yàn) 原 理l 凝 膠 過 濾 也 稱 凝 膠 層 析 ， 其 分 離 純 化 物質(zhì) 的 原 理 是 ， 凝 膠 具 有 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) ， 小 分 子 物質(zhì) 能 進(jìn) 入 其 內(nèi) 部 ， 而 大 分 子 物 質(zhì)

58、 卻 被 排 阻 在外 部 ， 當(dāng) 一 混 合 溶 液 通 過 凝 膠 過 濾 層 析 柱 時(shí) ，溶 液 中 的 物 質(zhì) 就 按 不 同 分 子 質(zhì) 量 被 分 開 了 。此 法 可 用 于 測 定 蛋 白 質(zhì) 的 分 子 質(zhì) 量 、 樣 品 的濃 縮 和 脫 鹽 等 方 面 。 l 目 前 常 用 的 凝 膠 有 葡 聚 糖 凝 膠 、 聚 丙 烯 酰胺 凝 膠 、 瓊 脂 糖 凝 膠 ， 其 中 最 常 用 的 是 葡 聚 糖凝 膠 。 葡 聚 糖 凝 膠 的 商 品 名 稱 為 Sephadex，它 是 葡 萄 糖 通 過 -1， 6-糖 苷 鍵 形 成 的 葡 聚 糖長 鏈 ， 與 交

59、 聯(lián) 劑 環(huán) 氧 氯 丙 烷 以 醚 鍵 相 互 交 連 而成 的 具 有 三 維 空 間 的 多 孔 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 物 ， 呈 珠 狀顆 粒 。 三 、 儀 器 、 材 料 和 試 劑 實(shí) 驗(yàn) 儀 器 鐵 架 臺 ； 層 析 柱 ； 滴 定 管 夾 ； 刻 度 離心 管 ； 白 瓷 板 ； Sephadex G-25（ 粒 度 粗 ，50 100目 ） ； 細(xì) 乳 膠 管 ； 螺 旋 夾 ； 燒 杯 。 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 10% 磺 柳 酸 ； 納 氏 試 劑 （ 萘 斯 特 試劑 ） ； 蛋 白 質(zhì) (NH4)2SO4溶 液 ； 無 離 子水 （ 洗 脫 液 ） 四 、 操 作 步 驟 與

60、 方 法 1. 溶 脹 凝 膠 ： 用 去 離 子 水 浸 泡 Sephadex G-25凝 膠 24h以上 （ 中 間 換 一 次 水 ） 或 用 去 離 子 水 沸 水 浴 溶 脹 2h左 右 。2. 凝 膠 裝 柱 ： 按 實(shí) 驗(yàn) 教 程 要 求 安 裝 層 析 裝 置 ， 將 溶 脹 好的 SephadexG-25裝 入 層 析 柱 中 。3. 洗 柱 ： 接 通 洗 脫 液 ， 按 要 求 洗 柱 并 調(diào) 整 好 流 速 。4. 加 樣 洗 脫 ： 吸 取 1ml樣 品 （ 蛋 白 質(zhì) 硫 酸 銨 溶 液 ） ， 小心 地 加 到 床 面 上 ， 擰 松 螺 旋 夾 ， 待 樣 品

61、全 部 進(jìn) 入 凝 膠 柱 中 ，接 通 洗 脫 液 ， 開 始 洗 脫 并 收 集 洗 脫 液 。5. 收 集 檢 查 ： 每 管 收 集 1ml洗 脫 液 。 取 洗 脫 液 2滴 加 入 白瓷 板 穴 中 ， 加 入 納 氏 試 劑 1滴 ， 如 有 銨 鹽 洗 脫 下 來 ， 則 有 黃紅 色 沉 淀 。 取 洗 脫 液 2滴 置 小 試 管 中 ， 加 入 磺 柳 酸 1滴 ， 如 有蛋 白 質(zhì) 洗 脫 下 來 ， 則 有 白 色 混 濁 或 沉 淀 出 現(xiàn) 。 五 、 思 考 題 ：l 1. 利 用 凝 膠 層 析 分 離 混 合 物 時(shí) ， 怎 樣 才 能 得 到較 好 的 分

62、離 效 果 ？l 2. 還 有 哪 些 方 法 可 進(jìn) 行 蛋 白 質(zhì) 脫 鹽 ？l 3. 蛋 白 質(zhì) 溶 液 中 的 鹽 分 為 何 能 通 過 凝 膠 過 濾 方法 被 脫 除 ？l 4. 凝 膠 過 濾 法 在 蛋 白 質(zhì) 分 析 中 還 有 何 應(yīng) 用 ？ 實(shí) 驗(yàn) 六 酵 母 RNA的 分 離 及 組 分 鑒 定 一 、 實(shí) 驗(yàn) 目 的l (1)學(xué) 習(xí) 稀 堿 法 提 取 RNA的 原 理 和 操 作 方 法 。(2)了 解 核 酸 的 組 分 ， 并 掌 握 鑒 定 核 酸 組 分的 方 法 。 二 、 實(shí) 驗(yàn) 原 理l 酵 母 核 酸 中 RNA含 量 較 多 。 RNA可 溶 于

63、 堿性 溶 液 ， 在 堿 提 取 液 中 加 入 酸 性 乙 醇 溶 液 可以 使 解 聚 的 核 糖 核 酸 沉 淀 ， 由 此 即 得 到 RNA的粗 制 品 。 核 糖 核 酸 含 有 核 糖 、 嘌 呤 堿 、 嘧 啶 堿 和磷 酸 各 組 分 。 加 硫 酸 煮 沸 可 使 其 水 解 ， 從 水解 液 中 可 以 測 出 上 述 組 分 的 存 在 。 三 、 儀 器 、 材 料 和 試 劑實(shí) 驗(yàn) 儀 器 1 乳 缽 2 150mL錐 形 瓶 3 水 浴 4 量 筒 5 布氏 漏 斗 及 抽 濾 瓶 6 吸 管 7 滴 管 8 試 管 及 試 管架 9 燒 杯 10 離 心 機(jī)

64、11 漏 斗 。 實(shí) 驗(yàn) 試 劑1 氯 化 鐵 濃 鹽 酸 溶 液 2 苔 黑 酚 乙 醇 溶 液 3 定 磷 試 劑 （ 1） 17 硫 酸 溶 液 將 17 mL濃 硫 酸 (比 重 1 84)緩 緩加 入 到 83mL水 中 。（ 2） 2 5 鉬 酸 銨 溶 液 將 2 5g鉬 酸 銨 溶 于 100mL水 中 。（ 3） 10 抗 壞 血 酸 溶 液 10 g抗 壞 血 酸 溶 于 100 mL水 中 ，貯 棕 色 瓶 保 存 。 溶 液 呈 淡 黃 色 時(shí) 可 用 ， 如 呈 深 黃 或 棕 色 則 失效 ， 需 純 化 抗 壞 血 酸 。臨 用 時(shí) 將 上 述 3種 溶 液 與

65、水 按 如 下 比 例 混 合 。17 硫 酸 溶 液 :2.5 鉬 酸 銨 溶 液 :10 抗 壞 血 酸 溶 液 :水 =1:1:1:2(V V)。4 酵 母 粉 四 、 操 作 步 驟 與 方 法 1.提 取 將 15 g酵 母 懸 浮 于 90 mL 0.04 mol L氫 氧 化 鈉 溶 液中 ， 并 在 乳 缽 中 研 磨 均 勻 。 將 懸 浮 液 轉(zhuǎn) 移 至 150毫 升 錐 形 瓶 中 。在 沸 水 浴 上 加 熱 30分 鐘 后 ， 冷 卻 。 離 心 (3 000r min)15分 鐘 ，將 上 清 液 緩 緩 傾 人 30 mL酸 性 乙 醇 溶 液 中 。 注 意 要

66、 一 邊 攪 拌一 邊 緩 緩 傾 人 。 待 核 糖 核 酸 沉 淀 完 全 后 ， 離 心 (3000r min)3分 鐘 。 棄 去 清 液 。 用 95 乙 醇 洗 滌 沉 淀 兩 次 ， 乙 醚 洗 滌 沉 淀一 次 后 ， 再 用 乙 醚 將 沉 淀 轉(zhuǎn) 移 至 布 氏 漏 斗 中 抽 濾 。 沉 淀 可 在空 氣 中 干 燥 。 取 200mg提 取 的 核 酸 ， 加 入 1.5 mol L硫 酸 溶 液 10mL，在 沸 水 浴 中 加 熱 10分 鐘 l 2、 制 成 水 解 液 并 進(jìn) 行 組 分 的 鑒 定l （ 1） 嘌 呤 堿 取 水 解 液 1 mL加 入 過 量 濃 氨 水 ，然 后 加 入 約 1 mL 0 1 mol L硝 酸 銀 溶 液 ， 觀察 有 無 嘌 呤 堿 的 銀 化 合 物 沉 淀 。（ 2） 核 糖 取 1支 試 管 加 人 水 解 液 1 mL、 三 氯化 鐵 濃 鹽 酸 溶 液 2mL和 苔 黑 酚 乙 醇 溶 液 0 2 mL。放 沸 水 浴 中 10分 鐘 。 注 意 溶 液 是 否 變 成 綠 色 ，說 明 核 糖 的 存