β3 .AR激動(dòng)劑BRL35135、氯沙坦和二甲雙胍對(duì)肥胖大鼠心肌UCP.2mR

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1、β3 .AR激動(dòng)劑BRL35135、氯沙坦和二甲雙胍對(duì)肥胖大鼠心肌UCP.2mR 　　前列腺癌細(xì)胞　　Abstract:Objective To detect multidrug resistance in bladder tumor，thus to select sensitive drugs to treat invasive bladder tumor.Method In10cases of bladder tumors，P-gp，GST-p and TopoⅡwere detected by immunohistochemistry technique before

2、 intra-arterial chemotherapy.Results Before intra-arterial chemotherapy the expression rate of P-gp was30%，GST-p was10%，TopoⅡwas50%.Chemotherapy drug were THP，DDP and HCPT.After intra-arterial chemothera-py，the expression rate of P-gp was50%，GST-p was20%，TopoⅡwas40%，respectively.Conclusion Detection

3、 of P-gp，GST-p and TopoⅡplay a role in selection of drug in invasive bladder tumor.　　Key words:bladder tumor;multidrug resistance;immunohistochemistry;chemotherapy［摘要］目的: 探討過(guò)氧化物還原酶1（Prx1）表達(dá)增加對(duì)人腫瘤細(xì)胞抗過(guò)氧化氫毒性作用的影響。 方法: 構(gòu)建Prx1真核表達(dá)質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人PC3前列腺癌細(xì)胞，用Western blot檢測(cè)Prx1在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞中的表達(dá)，用MTT法觀察細(xì)胞的存活率。 結(jié)果: W

4、estern blot分析表明，Prx1真核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞表達(dá)Prx1顯著增加;MTT分析表明，在過(guò)氧化氫濃度為0.25、0.5、1和2mmolL-1 時(shí)，Prx1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞存活率顯著增加。 結(jié)論: Prx1高表達(dá)顯著增強(qiáng)人PC3前列腺癌細(xì)胞抗過(guò)氧化氫毒性作用。　?。坳P(guān)鍵詞］ 過(guò)氧化物還原酶1;前列腺癌細(xì)胞;過(guò)氧化氫;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 　　在正常細(xì)胞代謝和對(duì)外部刺激的反應(yīng)過(guò)程中，細(xì)胞可產(chǎn)生活性氧，包括氧自由基和過(guò)氧化氫（H2 O2 ）等等。低濃度活性氧可促進(jìn)多種細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖［1］ ;相反，活性氧異常增加導(dǎo)致細(xì)胞損傷、死亡［2，3］ 。為了對(duì)抗高濃度活性氧的毒性作用，經(jīng)過(guò)

5、漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化，需氧生物特別是人類細(xì)胞都有一整套抗氧化防御機(jī)制，包括過(guò)氧化氫酶（catalase，Cat）、超氧化物歧化酶（su-peroxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，Glu）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、硫代還原物（thioredoxin，Trx）、硫代還原物還原酶（thioredoxin reductase，TR）和過(guò)氧化物還原酶（peroxiredoxin，Prx）［4］ 等等?！　rx是一類新定義的抗氧化物，在生物進(jìn)化中高度保守，從低等原核生物細(xì)菌到高等生物人類，均有Prx表達(dá)。迄今，這個(gè)家族

6、已有數(shù)百個(gè)成員。在人類組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了6種Prx［5］ ，其中，Prx1、Prx2、Prx3和Prx4含有兩個(gè)保守的以半胱氨酸為中心的活性區(qū)域，稱為2.Cys Prx;而Prx5羧基端半胱氨酸不在保守區(qū)域，稱為非典型的2.Cys Prx;Prx6缺乏羧基端半胱氨酸，稱為1.Cys Prx。在這些Prx中，Prx1、2和6位于細(xì)胞漿內(nèi)，Prx3特異性位于線粒體內(nèi)，Prx4為分泌型，Prx5既位于過(guò)氧化物酶體，又位于線粒體內(nèi)。已有資料表明，許多Prx能夠降低H2 O2 和其他過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞的損害。Prx1轉(zhuǎn)染能提高人內(nèi)皮細(xì)胞抗H2 O2 毒性作用［6］ ;Prx1或Prx2轉(zhuǎn)染能降低H2 O2 誘

7、導(dǎo)的大鼠甲狀腺細(xì)胞FRTL.5的凋亡［7］ 。與相應(yīng)的周圍組織比較，胰腺癌［8］ 和間皮瘤［9］ 組織表達(dá)Prx1增多;乳腺癌［10］ 、肝細(xì)胞癌［11］ 和間皮瘤［9］ 組織表達(dá)Prx3增多。本研究將觀察Prx1穩(wěn)定高表達(dá)是否影響人PC3前列腺癌細(xì)胞對(duì)H2 O2 的敏感性。 　　1 材料與方法　　1.1 試驗(yàn)材料　　限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）和抗微管蛋白抗體購(gòu)自Sigma公司?？筆rx1多克隆抗體和pT7Prx1質(zhì)粒參見文獻(xiàn)［5］。 　　1.2 質(zhì)粒構(gòu)建　　用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ酶切pT7Prx1生成人Prx1cDNA完整開放讀碼框架（ope

8、n reading frame，ORF），與經(jīng)同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3連接，生成質(zhì)粒pcDNA.Prx1。 　　1.3 細(xì)胞培養(yǎng)　　人PC3前列腺癌細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司）被置于含10%胎牛血清、2mmolL-1 谷氨酰胺、100kUL-1 青霉素和100mgL-1 鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞于2～3d基本融合，用0.125%胰蛋白酶.0.5%EDTA混合液消化，按1∶3～1∶4傳代培養(yǎng)。 　　1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染　　PC3細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中于體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2 中37℃培養(yǎng)16～20h后，以pcDNA3空載

9、體為陰性對(duì)照，用lipofectamineTM 2000（Invitrogen）將pcDNA.Prx1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h。然后1∶10傳代，并用400mgL-1 G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 　　1.5 Western blot分析　　用冰冷PBS溶液洗上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞2遍后，加入RIPA細(xì)胞裂解液。收集細(xì)胞裂解物，置冰浴孵育10min，然后4℃、14000rmin-1 離心10min，取上清液進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。分別用抗Prx1抗體和抗微管蛋白抗體及相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（Amersham）檢測(cè)Prx1和微管蛋白（作為對(duì)照），然后與增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（Amersham）

10、反應(yīng)1min。將膜用保鮮膜包好，置暗盒中。在暗室內(nèi)壓上X光片，曝光適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。取出X光片，進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘@影和定影，以顯示各蛋白條帶。 　　1.6 MTT分析 　　以每孔4103 密度接種pcDNA3載體或pcDNA3.Prx1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板各孔中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。以未加H2 O2 的完全培養(yǎng)基為對(duì)照，用含0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2和4mmolL-1 H2 O2 的完全培養(yǎng)基分別處理細(xì)胞24h后，每孔加入10μl MTT.PBS（5gL-1 ）。4h后加入100μl異丙醇.0.05μmolL-1 鹽酸，測(cè)定各孔OD570 的值，計(jì)算各孔細(xì)胞存活率。 　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　　數(shù)據(jù)以ˉxs表示，并用ANOVA和Kruskal-Wallis分析進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)。