分子生物學前沿技術

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1、激光捕獲顯微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破壞組織結構，保存要捕獲的細胞和其周圍組織形態(tài)完整的前提下，直接從冰凍或石蠟包埋組織切片中獲取目標細胞 ，通常用于從組織中精確地分離一個單一的細胞。 背景：機體組織包含有上百種不同的細胞，這些細胞各自與周圍的細胞、基質、血管、腺體、炎癥細胞或免疫細胞相互粘附。在正?；虬l(fā)育中的組織器官內，細胞內信號、相鄰細胞的信號以及體液刺激作用于特定的細胞，使這些細胞表達不同的基因并且發(fā)生復雜的分子變化。在病理狀態(tài)下，如果同一類型的細胞發(fā)生了相同的分子改變，則這種分子改變對于疾病的發(fā)生可能起著關

2、鍵性的作用。然而，發(fā)生相同分子改變的細胞可能只占組織總體積的很小一部分；同時，研究的目標細胞往往被其它組織成分所環(huán)繞。為了對疾病發(fā)生過程中的組織損害進行分子水平分析，分離出純凈的目標細胞就顯得非常必要。1996年，美國國立衛(wèi)生院（NIH）國家腫瘤研究所的[2]開發(fā)出激光捕獲顯微切割技術（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美國Arcturus Engineering公司成功研制激光捕獲顯微切割系統(tǒng)，并實現(xiàn)商品化銷售。應用該技術可以在顯微鏡直視下快速、準確獲取所需的單一細胞亞群，甚至單個細胞，從而成功解決了組織中細胞異質性問題。這項技術現(xiàn)已成為美國“腫

3、瘤基因組解剖計劃”的一項支撐技術[1]。 原理：LCM的基本原理是通過一低能紅外激光脈沖激活熱塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近紅外激光波長），在直視下選擇性地將目標細胞或組織碎片粘到該膜上[2]。LCM 系統(tǒng)包括倒置顯微鏡、固態(tài)紅外激光二極管、激光控制裝置、控制顯微鏡載物臺（固定載玻片）的操縱桿、電耦合相機及彩色顯示器。用于捕獲目標細胞的熱塑膜直徑通常為6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰與后繼實驗所用的標準 0.5ml離心管相匹配。 機械臂懸掛控制覆有熱塑膜的塑料帽，放到脫水組織切片上的目標部位。顯微鏡直視下選擇目標細胞，發(fā)

4、射激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，并在幾毫秒內迅速凝固。組織與膜的粘合力超過了其與載玻片間的粘合力，從而可以選擇性地轉移目標細胞。激光脈沖通常持續(xù)0.5~5.0毫秒，并且可在整個塑料帽表面進行多次重復，從而可以迅速分離大量的目標細胞。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，將所選擇的細胞轉移至離心管中，從而可以分離出感興趣的分子進行實驗[3]。 EVA膜約100~200μm厚，能夠吸收激光產生的絕大部分能量，在瞬間將激光束照射區(qū)域的溫度提高到90C，保持數(shù)毫秒后又迅速冷卻，保證了生物大分子不受損害。采用低能量紅外激光的同時也可避免損傷性光化學反應

5、的發(fā)生。 優(yōu)缺點：LCM最顯著的優(yōu)點在于其迅速、準確和多用途的特性。結合組織結構特點以及所需的切割精確度，通過選擇激光束的直徑大小，可以迅速獲取大量的目標細胞。LCM與以顯微操作儀為基礎的顯微切割技術相比[4]，具有以下優(yōu)點：(1)分離細胞速度快，無需精巧的操作技能；(2)捕獲細胞和剩余組織的形態(tài)學特征均保持完好，可以較好地控制捕獲細胞的特異性；(3)捕獲細胞與塑料帽結合緊密，減少了組織損失的風險。相比而言，除了激光切割彈射微分離系統(tǒng)[5]以經染色的用于存檔的切片也可被成功進行顯微切割。 盡管LCM應用廣泛，但對于常規(guī)染色、固定且不加蓋玻片的組織切片，其視覺分辨率受到很大限制。而對于那些本

6、身缺乏一定結構特點的復雜組織（如淋巴組織，廣泛浸潤的腺癌等），要準確分離出某一類細胞幾乎是不可能的。Fend等[6]通過采用特殊染色，尤其是免疫組化方法，使目標細胞或想要去除的細胞變得更加醒目，從而解決了上述難題。 應用LCM，偶爾會出現(xiàn)無法將選擇的細胞從切片上移走的情況，出現(xiàn)這種結果有兩種原因：(1)細胞與熱塑膜之間的粘合力不足，通常是由于組織未完全脫水或激光的能量設置過低造成的；(2)組織切片與載玻片間的粘合力過強，通常發(fā)生在顯微切割干燥時間過長的冰凍切片。針對不同樣本組織（包括免疫組化染色的組織切片），一些研究小組分別詳盡報道了采用適合的處理方法，以達到最佳的顯微切割條件[7]。 應

7、用：LCM較以往的顯微切割技術有了突破性的進展，現(xiàn)已廣泛應用于腫瘤研究，包括前列腺癌[8]、腎癌、肺癌、甲狀腺癌[9]、食管癌、胃癌、肝癌、膽管癌、結腸癌、乳腺癌、膠質瘤、惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM還成功應用于其它一些疾病的研究中，如Crohn病[10]、肌萎縮性側索硬化癥[11]、子宮內膜異位癥、獲得性免疫缺陷綜合征、結核病、丙型肝炎等。而應用LCM所分離的組織也多種多樣，包括單個細胞、單一細胞群（主要是癌巢）、血管等類型。 展望：LCM成功解決了組織異質性問題，且具有迅速、準確等諸多優(yōu)點，已被廣泛應用于腫瘤等疾病基因水平的研究中，并顯示出了良好的應用前景[1]。但今后

8、可能還需要以下幾個主要方面的發(fā)展和完善：理論上，除上述組織及細胞以外，LCD還可應用于其他所有組織細胞（如脾臟巨噬細胞、肝臟Kuffer細胞等）的分離，但其各自的切片制備、染色等技術方法尚需要進行探索；開發(fā)相應的應用程序，僅需輸入目標細胞或組織的特異性參數(shù)即可實現(xiàn)計算機自動控制LCD[12]，從而大大縮減所需的人力和時間；提高捕獲單個細胞的精確度，以減少非目標組織的沾染；進一步優(yōu)化快速免疫組化染色的步驟，改進DNA和 RNA抽提技術，實現(xiàn)從少量捕獲細胞或組織中獲得高質量的核酸。 變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromat

9、ography，DHPLC） 原理：在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。 用離子對反向高效液相色譜法：⑴在不變性的溫度條件下，檢測并分離分子量不同的雙鏈DNA分子或分析具有長度多態(tài)性的片段，類似RFLP分析，也可進行定量RT—PCR及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性測定（MSI）；⑵在充分變性溫度條件下，可以區(qū)分單鏈DNA或RNA分子，適用于寡核苷酸探針合成純度分析和質量控制；⑶在

10、部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產物經過變性復性過程，不僅分別形成同源雙鏈，同時也錯配形成異源雙鏈，根據(jù)柱子保留時間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，從而識別變異型。根據(jù)這一原理，可進行基因突變檢測、單核苷酸多態(tài)性分析SNPs等方面的研究。 優(yōu)點：近年來建立并迅速發(fā)展的DHPLC是一種新型基因突變篩查技術，既能夠自動化、高通量進行，且除PCR之外，勿需進行PCR引物修飾、購買特殊試劑、檢測標記信號或作其它的樣品處理。而目前已有的許多DNA突變分析技術諸如單鏈構象多態(tài)性 (single-strand conformation polymorphism，SSCP)、變性梯度凝膠電泳法(

11、denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等均不能滿足此要求。DHPLC具有高通量檢測、自動化程度高、靈敏度和特異性較高、檢測DNA片段和長度變動范圍廣、相對價廉等優(yōu)點。與傳統(tǒng)的SSCP、DGGE等方法相比，DHPLC有較多的優(yōu)點。SSCP的結果受血樣質量、提取方法等因素的影響，并且需要跑膠、電泳；DGGE則需要標記引物，存在放射性污染，這兩種方法都比較費時費力。而DHPLC則高度自動化，可以自動取樣，檢測每個樣品只需要8分鐘左右。DHPLC與其他檢測DNA突變方法的最大不同在于，它能夠純化DNA片斷。當然，只能檢測雜合突變是DHPLC的不足之

12、處，但是這可以利用混合的方法（即將純合突變樣品和野生型樣品混合）來解決。 多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）于2002年由Schouten等首先報道，是近幾年發(fā)展起來的一種針對待檢DNA序列進行定性和半定量分析的新技術。該技術高效、特異，在一次反應中可以檢測45個核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，目前已經應用于多個領域、多種疾病的研究。 原理：MLPA的基本原理包括探針和靶序列DNA進行雜交，之后通過連接、PCR擴增，產物通過毛細管電泳分離及數(shù)據(jù)收集，分析軟件對收集的數(shù)據(jù)進行分析最后

13、得出結論。每個MLPA探針包括兩個熒光標記的寡核苷酸片段，一個由化學合成，一個由M13噬菌體衍生法制備；每個探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反應中，兩個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交，之后使用連接酶連接兩部分探針。連接反應高度特異，只有當兩個探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有一個堿基的差別，就會導致雜交不完全，使連接反應無法進行。連接反應完成后，用一對通用引物擴增連接好的探針，每個探針的擴增產物的長度都是唯一的，范圍在130～480bp。最后，通過毛細管電泳分離擴

14、增產物，Genemarker軟件分析，得出結論。只有當連接反應完成，才能進行隨后的PCR擴增并收集到相應探針的擴增峰，如果檢測的靶序列發(fā)生點突變或缺失、擴增突變，那么相應探針的擴增峰便會缺失、降低或增加，因此，根據(jù)擴增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數(shù)的異常或點突變存在。 應用： 檢測染色體亞端粒的基因重排 智力低下是遍及全世界的嚴重危害兒童身心健康的一類疾患，其中一部分是由可知原因引起的，包括感染、中毒、腦疾病等，但是很大一部分患兒的病因不明。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，包括亞端粒在內的基因重排是引起智力低下的重要原因[M,N]，因為亞端粒的基因非常豐富，微小的改變就會累及眾多的基因，從而導致疾

15、病的發(fā)生。目前，應用較多的檢測染色體亞端粒的方法包括染色體核型分析，熒光原位雜交（FISH），但是前者不能檢出亞端粒微小的基因重排，而后者費時、費力、又非常昂貴，不易推廣。MLPA-P036和MLPA-P070試劑盒，針對每一個染色體的末端都設計有一個特異性探針，它經濟、高效、快速，可以用于檢測亞端粒的基因重排[P,Q]，揭示部分智障患兒的發(fā)病原因。 檢測染色體的非整倍性改變[S,T] 目前，檢測染色體的非整倍性改變的方法主要為染色體核型分析，但是它在檢測羊水細胞、絨毛或是其他胎兒細胞時，需要進行體外細胞培養(yǎng)，若培養(yǎng)失敗、細胞過少或染色體形態(tài)較差時，常常影響實驗結果。應用MLPA檢測這類標

16、本時，不需要體外培養(yǎng)，少量標本即可進行檢測，針對易發(fā)生非整倍性改變的染色體（13，18，21，X，Y）上的幾個熱點基因設計特異性探針，根據(jù)特定基因拷貝數(shù)的改變，即可確定染色體數(shù)目的異常。 檢測單核苷酸的多態(tài)性（SNP）和點突變 根據(jù)MLPA的原理可知，靶序列DNA只要有一個堿基的改變，便可導致雜交不完全，使其擴增產物缺失，因此，MLPA高度特異性的檢測可用于多種SNP和點突變。 幾種常見的兒童遺傳性疾病的檢測 1）智力低下綜合征 多種已知的智力低下綜合征與染色體特定區(qū)域的基因改變相關。這些患兒臨床表現(xiàn)復雜，個體差異大，缺乏特征性表現(xiàn)，醫(yī)生很難作出準確診斷。MLPA-P064試劑盒，針

17、對特定的染色體區(qū)域設計了43個探針，可以明確幾種疾病的診斷[A]，包括：1p-缺失綜合征，Williams綜合征，Smith-Magenis綜合征，Miller-Dieker綜合征，Digeorge綜合征[W]，Alagille綜合征，Sotos綜合征。根據(jù)同樣的原理，MLPA-P096試劑盒可檢測的疾病包括：Wolf-Hirschhorn綜合征，Cri du Chat綜合征，WAGR綜合征，Downs綜合征等。 2）X連鎖型智力低下[C] X連鎖型智力低下可以分為綜合征型和非綜合征型，前者具備特征性的臨床表現(xiàn)，而后者沒有特異性癥狀，智力低下常常為患兒的唯一表現(xiàn)。目前已經發(fā)現(xiàn)19個基因與

18、X連鎖型智力低下相關，MLPA-P106可以檢測其中14個相關基因的改變。 3）假肥大型肌營養(yǎng)不良癥[D,E,F] 假肥大型肌營養(yǎng)不良癥包括Duchenne型肌營養(yǎng)不良（DMD）和Becker型肌營養(yǎng)不良，臨床表現(xiàn)主要為骨盆帶肌和下肢近端肌肉無力，腓腸肌假性肥大等，致病基因位于Xp21.2，包括70多個外顯子。疾病的發(fā)生與DMD基因的缺失、重復或點突變相關。MLPA-P034和MLPA-P035試劑盒設計了80多個探針可以檢測每一個外顯子的缺失或重復突變，及部分點突變。 4）Prader-Willi綜合征（PWS）和Angelman綜合征（AS）[H,I] PWS和AS都是由染色體15

19、q11-13缺失或同源二倍體所致。如果是父源性染色體15q11-13缺失或母源性同源二倍體則引起PWS，如果是母源性染色體15q11-13缺失或父源性同源二倍體則引起AS。在人類，父源15q11-13區(qū)域存在非甲基化的SNRPN印跡基因，母源性15q11-13區(qū)域存在完全甲基化的SNRPN印跡基因。甲基化特異性的MLPA試劑盒ME028采用半定量式的方式可以檢測基因拷貝數(shù)的改變，探針所識別的DNA序列包括甲基化敏感的核酸內切酶HhaⅠ位點，因此可以分析CpG島的甲基化狀態(tài)，從而區(qū)別PWS和AS。 5）其他疾病的檢測 MLPA還可以用于成神經細胞瘤[J]、a-地中海貧血[K]等疾病的診斷。成

20、神經細胞瘤是兒童中樞神經系統(tǒng)發(fā)生的腫瘤，明確特征性基因的改變對確認神經腫瘤發(fā)生的過渡階段、治療和預后都有重要意義，為臨床提供極大的幫助。 優(yōu)缺點：MLPA結合了DNA探針雜交和PCR技術，具有以下優(yōu)點1、高效：一次反應可以檢測45個靶序列拷貝數(shù)的改變。2、特異：可以檢測點突變。3、快速：一次實驗可以在24小時內完成。4、簡便：不同的試劑盒操作基本相同，容易掌握。 MLPA雖然具有很大優(yōu)點，但也有其局限性1、需要精確測量DNA的濃度，樣本容易被污染。2、不能用于單個細胞的檢測。3、MLPA用于檢測基因的缺失或重復，不適合檢測未知的點突變類型。4、不能檢測染色體的平衡易位。

21、單核苷酸多態(tài)性SNP 全稱Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因組上單個核苷酸的變異，包括轉換、顛換、缺失和插入，形成的遺傳標記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。從理論上來看每一個SNP位點都可以有4 種不同的變異形式,但實際上發(fā)生的只有兩種，即轉換和顛換,二者之比為2：1[1]。SNP 在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉換為T ,原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化,而后自發(fā)地脫氨成為胸腺嘧啶。一般而言,SNP 是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000 個堿基就有一個SNP ,人類基因組上的SNP 總量大概是3 10^6 個 。因此,SN

22、P成為第三代遺傳標志,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關。 作用和成果：SNP研究是人類基因組計劃走向應用的重要步驟。這主要是因為SNP將提供一個強有力的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究等。SNP在基因組中分布相當廣泛，研究表明在人類基因組中每300堿基對就出現(xiàn)一次。大量存在的SNP位點，使人們有機會發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關的基因組突變；從實驗操作來看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導致疾病基因的表達，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標記。SNP在基礎研究中也發(fā)揮了

23、巨大的作用，通過對Y染色體SNP的分析，使得在人類進化、人類種群的演化和遷徙領域取得了一系列重要成果。 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。 SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。

24、但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。 理論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個或4個等位多態(tài)性，但實際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的。這種變異可能是轉換(C T，在其互補鏈上則為G A)，也可能是顛換(C A，G T，C G，A T)。轉換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。Wang等的研究也證明了這一點。轉換的幾率之所以高，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。 在基因組DNA中，任何堿

25、基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區(qū)內的SNP(coding SNP,cSNP)比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。 從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發(fā)生改變

26、，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。 先形成的SNP在人群中常有更高的頻率，后形成的SNP所占的比率較低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不盡相同，但大約有85%應是共通的。 特性：SNP自身的特性決定了它更適合于對復雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識別等方面的研究： 1、 SNP數(shù)量多，分布廣泛。據(jù)估計，人類基因組中每1000個核苷酸就有一個SNP，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs。SNP 遍布于整個人類基因組中，根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-r

27、egion SNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三類。 2、 SNP適于快速、規(guī)?；Y查。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標記，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發(fā)展自動化技術篩選或檢測SNPs。 3、 SNP等位基因頻率的容易估計。采用混和樣本估算等位基因的頻率是種高效快速的策略。該策略的原理是：首先選擇參考樣本制作標準曲線，然后將待測的混和樣本與標準曲線進行比較，根據(jù)所得信號的比例確定混和樣本中各種等位基因的頻率。 4、 易于基因分型。SNPs 的二態(tài)性，也有利于對其進行基因分型。對SNP進行基因分型包括三方面的內容：(1)鑒別基因型所采用的化學反應，常用的技術手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應、側翼探針切割反應以及基于這些方法的變通技術；(2)完成這些化學反應所采用的模式，包括液相反應、固相支持物上進行的反應以及二者皆有的反應。(3)化學反應結束后，需要應用生物技術系統(tǒng)檢測反應結果。