中國(guó)藥典衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)培訓(xùn)版《中國(guó)藥典》微生物檢驗(yàn)技術(shù)(崔學(xué)文).ppt

《中國(guó)藥典衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)培訓(xùn)版《中國(guó)藥典》微生物檢驗(yàn)技術(shù)(崔學(xué)文).ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《中國(guó)藥典衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)培訓(xùn)版《中國(guó)藥典》微生物檢驗(yàn)技術(shù)(崔學(xué)文).ppt（116頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、2010年版中國(guó)藥典微生物檢驗(yàn)技術(shù),崔學(xué)文 四川省食品藥品檢驗(yàn)所 2010年3月,主要內(nèi)容,一、藥品微生物檢驗(yàn)現(xiàn)狀 二、中國(guó)藥典2010年版微生物檢驗(yàn)增修訂 內(nèi)容簡(jiǎn)介 三、微生物檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn),(一)藥品微生物檢驗(yàn)現(xiàn)狀,,藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 【性狀】 【鑒別】 【檢查】 無菌/微生物限度 【含量測(cè)定】,藥品微生物檢驗(yàn)概況,藥品質(zhì)量體系,安全性,有效性,藥品質(zhì)量體系構(gòu)成與相互關(guān)系,藥品中污染的微生物通過微生物體及其分泌代謝產(chǎn)物導(dǎo)致機(jī)體過敏、中毒、感染等，嚴(yán)重的可以直接導(dǎo)致菌血癥危及生命。此外，某些藥品中污染微生物通過代謝活動(dòng)改變藥物組成、破壞有效成份而造成療效改變或喪失。,藥品微生物檢驗(yàn)概況,所以

2、，世界各國(guó)高度重視藥品微生物檢查，無菌/微生物限度檢查均為各國(guó)藥典中的重要內(nèi)容。,藥品微生物檢驗(yàn)概況,我國(guó)的微生物檢驗(yàn) 無菌檢查始于1953年新中國(guó)第一部藥典（版） 微生物限度檢查始于1972年 由來：1972年日商在進(jìn)口我國(guó)的中成藥中發(fā)現(xiàn)污染了大量細(xì)菌，同時(shí)還檢出大腸桿菌，向我方提出交涉，引起我國(guó)政府的高度重視，于是我國(guó)開始了微生物限度檢查工作，接著三部組織聯(lián)合調(diào)查京津滬的中藥廠，國(guó)務(wù)院為此發(fā)了73121號(hào)文件，要求加強(qiáng)管理提高中成藥的質(zhì)量,藥品微生物檢驗(yàn)概況,在中央和各地政府有關(guān)部門的關(guān)懷和重視下，經(jīng)過我國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)工作者幾十年來的艱苦奮斗，我國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)工作不斷發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)不斷完

3、善，逐步建立起了符合我國(guó)國(guó)情的藥品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)體系。 至2010版中國(guó)藥典，我國(guó)藥品無菌、微生物限度檢查方法和標(biāo)準(zhǔn)在科學(xué)性、合理性以及與國(guó)際接軌方面均有了長(zhǎng)足進(jìn)展，使我國(guó)藥品無菌和微生物限度檢查步入了一個(gè)嶄新的時(shí)期。,藥品微生物檢驗(yàn)概況,近3年來發(fā)生的藥害事件,技術(shù)落后、標(biāo)準(zhǔn)化程度低； 重要性被忽視、事故頻繁！ 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)步與標(biāo)準(zhǔn)化滯后的矛盾,藥品微生物檢驗(yàn)現(xiàn)狀,無菌檢查現(xiàn)狀,1、方法的修訂與完善 2、技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化 3、無菌檢查的幾個(gè)問題,1、方法的修訂與完善,2005年版無菌檢查法主要方面與USP、BP的比較,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基Fluid Thioglycollate Medium,20

4、05年版無菌檢查培養(yǎng)基與USP、BP的比較1,大豆胰酪胨培養(yǎng)基(TSB)改良馬丁培養(yǎng)基,2005年版無菌檢查培養(yǎng)基與USP、BP的比較2,,中國(guó)藥典無菌檢查培養(yǎng)基差異造成的問題與對(duì)策 問題：實(shí)驗(yàn)條件對(duì)號(hào)入座 漏檢 結(jié)果判斷對(duì)號(hào)入座 漏檢 對(duì)策：強(qiáng)調(diào)兩個(gè)培養(yǎng)基條件的互補(bǔ)性，實(shí)驗(yàn)上 同等對(duì)待，結(jié)果判斷上不要受誤導(dǎo)，避 免漏檢。,,,3、無菌檢查的幾個(gè)問題,1）、無菌檢查的認(rèn)識(shí)誤區(qū) 如何正確認(rèn)識(shí)無菌檢查？ 2）、抗菌藥物的無菌檢查 如何去除抗菌活性？ 3）、外用制劑及眼用制劑的無菌檢查 如何去除基質(zhì)影響？,1）、無菌檢查的認(rèn)識(shí)誤區(qū),“欣弗事件”反映了我國(guó)一些企業(yè)在微生物控制方面

5、存在的嚴(yán)重問題；而更為嚴(yán)重的是一些企業(yè)普遍存在的無菌檢查認(rèn)識(shí)誤區(qū)。,為什么要做無菌檢查？,1、有最后滅菌保證，中間不需要控制？ 2、我們現(xiàn)在生產(chǎn)條件很好，GMP，不用再?gòu)?qiáng)調(diào)終產(chǎn)品的檢查？,為什么抗生素產(chǎn)品也要做無菌檢查？,1、抗生素抗菌譜的限制； 2、污染微生物的亞致死、休眠狀態(tài)。,1、藥典要求。 2、抗生素產(chǎn)品的無菌檢查欣弗的情況如此，那么有“天然抗生素”美譽(yù)的魚腥草等中藥注射劑情況又該如何？ 3、近年來頻繁出現(xiàn)的中藥注射劑不良反應(yīng)問題有沒有污染微生物的可能？,為什么中藥注射用產(chǎn)品無菌檢查也要采用薄膜過濾法？,2）、抗菌藥物的無菌檢查,抗菌類藥物由于對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用，怎樣合理檢驗(yàn)，一直

6、爭(zhēng)論較多。這其中關(guān)鍵的困惑來自于關(guān)于藥品中受損、受抑制或處于靜息狀態(tài)微生物的基礎(chǔ)研究的缺乏。 肯定的一點(diǎn)是，應(yīng)盡量去除藥物對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。USP29每膜最多沖洗500ml；BP2002和JP14每膜沖洗不大于1000ml；中國(guó)藥典2005年版以所有陽性對(duì)照菌生長(zhǎng)為目標(biāo)。 去除抗生素抗菌的活性，使得處于亞致死、休眠狀態(tài)的污染微生物復(fù)蘇、生長(zhǎng)而得以檢出。,2）、抗菌藥物的無菌檢查,主要解決措施： 喹諾酮類以MnSO4溶液為中和劑； 參見：加替沙星無菌檢查方法的建立與標(biāo)準(zhǔn)操作探討 ，馬仕洪、劉鵬、戴翚，藥物分析雜志，2007，27（6）：877880 -內(nèi)酰胺類以-內(nèi)酰胺酶為中和劑； 參見：簡(jiǎn)

7、化注射用頭孢菌素?zé)o菌檢查法的探討，戴翚、劉鵬、馬仕洪，藥物分析雜志，2007，27（2）：208211 氨糖類及其他抗生素改善沖洗條件。 每膜沖洗500ml以內(nèi)基本都能解決問題。,,,,,,,,,,多價(jià)金屬陽離子對(duì)喹諾酮類的絡(luò)合作用,,五種喹諾酮類抗生素的結(jié)構(gòu)，并且由3、4位上的羰基與鎂、猛等金屬離子配位生成穩(wěn)定的六元環(huán)絡(luò)合物，藥物與金屬離子的絡(luò)合比為2：1,頭孢類抗生素?zé)o菌檢查,幾種頭孢菌數(shù)無菌檢查沖洗量,通過400ml稀釋液的溶解，濾過，采用0.1%蛋白胨溶液沖洗（表7），陽性對(duì)照菌均可正常生長(zhǎng)。,,從方法學(xué)研究到常規(guī)分析 ...,常規(guī)分析,SOP,驗(yàn)證,未生長(zhǎng),生長(zhǎng),假陰性的結(jié)果 ?

8、,陰性的結(jié)果？,陽性 的結(jié)果 ?,假陽性的結(jié)果？,方法學(xué)研究,,,,,,,,,,完全按照驗(yàn)證過的方法實(shí)施 / SOP,調(diào)查原因,,實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化 驗(yàn)證試驗(yàn)的系統(tǒng)化 制定標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)化 完備的實(shí)驗(yàn)室保障系統(tǒng) 最終目標(biāo)：一次檢驗(yàn)即可得到準(zhǔn)確結(jié)果。,微生物限度檢查現(xiàn)狀,1、方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善 2、技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化 3、微生物限度檢查的幾個(gè)問題,1、方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善,中國(guó)藥典2005版微生物限度檢查法與英美藥典比較,樣品10g或10ml+緩沖液至100ml,,總需氧菌TSA, 35 ,48-72h,真菌SDA(PDA), 20-25 ,5-7d,,,結(jié)果(cfu/ml or g),,,,取1

9、ml樣品液,,,,,USP、BP總需氣菌/霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)流程,總需氣菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù),中國(guó)藥典: 玫瑰紅鈉瓊脂, 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂,對(duì)供試品的前處理和一些檢驗(yàn)方法進(jìn)行了完善； 具有明顯的中國(guó)特色，與國(guó)際差距顯著。 計(jì)數(shù)測(cè)定體系的差異： 難以操作，檢驗(yàn)繁瑣 需氣菌總數(shù)=細(xì)菌數(shù)+霉菌及酵母菌？ 1000 1000 100 參見：美英歐藥典微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的淺析，蘇德模、胡昌勤、馬越，中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005年第3期,1、方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善,2、技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化,1）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 固體培養(yǎng)基的靈敏度。 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性

10、,當(dāng)染菌較多時(shí)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)大量的細(xì)菌，給結(jié)果判斷帶來困難。,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性,以中檢所玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：050428 ）與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：050523 ）比較，加入50100cfu陽性菌在相同條件培養(yǎng)觀察，見下表：,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,2、技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化,2）、自動(dòng)化程度低，仍然依賴大量的人工 以方法驗(yàn)證為基礎(chǔ)，引入更為便捷的供試品前處理技術(shù)，規(guī)范供試品前處理 有條件的地方可以考慮引入自動(dòng)稀釋、自動(dòng)接種、儀器判讀結(jié)果等設(shè)備和技術(shù) 3）、75mm薄膜過濾器的研制 征對(duì)我國(guó)中成藥品種多、情況復(fù)雜，開發(fā)研制的75mm薄膜過濾器在目前的驗(yàn)證工作中發(fā)揮

11、了重要作用。,中國(guó)藥品生物制品檢定所,36,75mm濾器,圖10 75mm濾器結(jié)構(gòu)細(xì)部,37,75mm濾器,（上）50mm薄膜上的大腸埃希菌菌落 （中）75mm薄膜上的金黃色葡萄球菌菌落 （下）75mm薄膜上的黑曲霉菌菌落,3、微生物限度檢查的幾個(gè)問題,原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題； 藥材原粉的界定問題； 含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的中成藥制劑標(biāo)準(zhǔn)問題； 純化水微生物限度檢查問題；,原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題,原料藥是藥品生產(chǎn)過程中引入微生物污染的重要來源之一，雖然一些藥品在生產(chǎn)過程或終產(chǎn)品階段可以采取一些滅菌措施殺滅污染微生物，但可能因?yàn)橛纱艘氲乃谰w、毒素等無法消除而危害患者，而原料藥過高的微生物

12、荷載可能直接挑戰(zhàn)一些滅菌措施的有效性，造成滅菌失敗，使藥品存在更大的安全隱患。所以世界各國(guó)藥典(原料品種占規(guī)定微生物限度品種數(shù):BP 和EP近90%,USP約30%)均規(guī)定應(yīng)對(duì)原料藥進(jìn)行微生物檢查，以消除或控制其對(duì)藥品引入的微生物污染。(有最后滅菌保證，中間不需要控制？),在嚴(yán)格執(zhí)行藥品GMP的前提下，國(guó)外藥典更為重視 原料藥的微生物檢查，尤其是對(duì)一些非滅菌制劑，甚至僅僅對(duì)原料藥有微生物限度控制要求，而對(duì)制劑沒有強(qiáng)制要求。中國(guó)藥典2005版參考了國(guó)外藥典的這一發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)于化學(xué)藥品的片劑、膠囊劑、顆粒劑等6個(gè)主要口服制劑在各論和制劑通則中均未做微生物限度檢查的強(qiáng)制要求，僅在附錄中做出通用性要求

13、，但很多企業(yè)不清楚這一變化的背景和兩個(gè)必要前提，即嚴(yán)格的原料藥微生物控制和嚴(yán)格的GMP管理，從而放松了對(duì)這些產(chǎn)品的微生物控制，可能會(huì)存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。(我們現(xiàn)在生產(chǎn)條件很好，GMP，不用再?gòu)?qiáng)調(diào)終產(chǎn)品的檢查？),原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題,中國(guó)藥典規(guī)定，對(duì)藥品原輔料藥的微生物檢查參照相應(yīng)用途的藥品進(jìn)行，即用于非滅菌制劑生產(chǎn)的原料藥應(yīng)按相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微生物限度控制；而用于滅菌制劑的原料藥一般應(yīng)符合無菌要求。考慮到生產(chǎn)過程中污染微生物可能發(fā)生的變化，國(guó)外企業(yè)通常在生產(chǎn)上自覺執(zhí)行比制劑要求更為嚴(yán)格的原料藥微生物標(biāo)準(zhǔn)。,原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題,原料藥的微生物標(biāo)準(zhǔn)問題,（1）重視不夠 目前一些企業(yè)

14、對(duì)原料藥微生物控制的重要性和意義認(rèn)識(shí)不夠，對(duì)源頭上的問題解決不好，加之GMP執(zhí)行流于形式，造成了頻繁的藥品微生物污染事故發(fā)生。 （2）標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)不清楚 目前中國(guó)藥典絕大多數(shù)藥品原輔料各論項(xiàng)下沒有明確的微生物檢查標(biāo)準(zhǔn)，而是需要根據(jù)實(shí)際用途去確定相應(yīng)的控制標(biāo)準(zhǔn)。 （3）抽樣不正確 原料藥微生物檢查的抽樣除了應(yīng)參照相應(yīng)的抽樣原則，還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是抽樣的環(huán)境要求和無菌操作要求，不當(dāng)?shù)某闃臃椒ú粌H可以使得樣本對(duì)總體沒有代表意義、抽取的樣本被污染，甚至可因抽樣而污染原料。 （4）方法不合理 對(duì)于原料藥微生物檢查方法驗(yàn)證應(yīng)與藥品制劑微生物檢查方法驗(yàn)證同等重視，否則同樣存在檢驗(yàn)方法不合理、不科學(xué)，檢驗(yàn)結(jié)果

15、沒有意義的問題。,純化水問題,USP31/Water for Pharmaceutical Purpose Drinking Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.0mL minimun Maximun action levels are 500 cfu per mL Purified Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.0mL minimun

16、 Maximun action levels are 100 cfu per mL Water for Injection: Membrane Filtraion Method Sample Volume-100mL minimun Maximun action levels are 10 cfu per 100mL,Purified Water:pour plate or membrane filtration method1 Sample Volume1.0 mL minimum2 Growth MediumPlate Cou

17、nt Agar3 Incubation Time48 to 72 hours minimum Incubation Temperature30 to 35 2 Nevertheless, in a very low to nil count scenario, a maximum sample volume of around 250 to 300 mL is usually considered a reasonable balance of sample collecting and processing ease and increased statistic

18、al reliability. 3 Also known as Standard Methods Agar, Standard Methods Plate Count Agar, or TGYA, this medium contains tryptone (pancreatic digest of casein), glucose and yeast extract.,純化水問題,2005版二部P303 2010版二部P412 純化水（Purified Water） 【檢查】微生物限度 取本品，采用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄XI J），細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)每1ml不得過100個(gè)。 這

19、一標(biāo)準(zhǔn)源于國(guó)外，在其需氣菌培養(yǎng)基統(tǒng)一規(guī)定的情況下簡(jiǎn)單易行。但我國(guó)引入后，造成企業(yè)大量的意見。在藥典現(xiàn)有條件下實(shí)際采用2ml實(shí)驗(yàn)，1ml測(cè)定細(xì)菌數(shù)、1ml測(cè)定霉菌和酵母菌數(shù)，再加合起來作為一個(gè)檢驗(yàn)結(jié)果。 主要問題還是培養(yǎng)基和檢驗(yàn)體系的差異。,(二) 中國(guó)藥典2010年版微生物檢驗(yàn)增修訂內(nèi)容簡(jiǎn)介,,中國(guó)藥典2010年版框架(衛(wèi)),中國(guó)藥典2010年版(衛(wèi)) 無菌檢查法 微生物限度檢查法 滅菌法 抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則 微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則,2010版無菌檢查法修訂,2010年版中國(guó)藥典一、二、三部的無菌檢查法基本延續(xù)2005

20、年版。 2010年版中國(guó)藥典三部逐漸向一、二部看齊。,2010版無菌檢查法修訂,1、附錄 103 頁，附錄XI H 無菌檢查法 第 6 行，增加“防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出” 理由：因?yàn)橛行?shí)驗(yàn)人員對(duì)樣品的處理和火焰上的操作直接影響供試品中微生物的檢出。 2、附錄 103 頁，附錄XI H 無菌檢查法 第 13 行，增加“無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)” 理由（1） 無菌檢查是高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品關(guān)乎用藥安全的必檢項(xiàng)目，為保證檢驗(yàn)質(zhì)量，必須有人員素質(zhì)的保證。,而且，無菌檢查是以一次檢出不得復(fù)試的檢驗(yàn)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)人員必須對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有微生物學(xué)的判斷能力:確定污染來

21、源,污染菌類別或定性及是否重試等。因此無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)，取得相應(yīng)的上崗證。否則是不能勝任該崗位工作的.理由（2） 從全國(guó)藥檢系統(tǒng)特別是藥品生產(chǎn)企業(yè)中的用人情況來看，對(duì)從事無菌檢查的崗位要求不明確，崗位上的人員也不被重視，存在著不穩(wěn)定、學(xué)歷偏低、素質(zhì)偏低的情況。藥典中增加這條規(guī)定可以保持該崗位人員的價(jià)值和穩(wěn)定性。理由（3） 美國(guó)藥典無菌檢查法中也有人員的要求。,2010版無菌檢查法修訂,3、附錄 103 頁，培養(yǎng)基 第 5 行，“三周”修訂為“3周” 第 6 行，“一年”修訂為“1年” 4、附錄 103 頁，培養(yǎng)基 第 7 行，刪除“（用于培養(yǎng)好氧菌、厭

22、氧菌）” 倒第 6行，刪除“（用于培養(yǎng)真菌）” 理由：考慮所用培養(yǎng)基與USP/BP/EP不一致的問題，避免對(duì)號(hào)入座，減少漏檢的機(jī)會(huì)，有利于提高污染菌的檢出率。,2010版無菌檢查法修訂,11、附錄 104 頁，薄膜過濾法 左第1行，“將規(guī)定量”修訂為“取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種” 左第1行，增加“總量” 左倒第1行，“按”修訂為“置” 12、附錄 105 頁，直接接種法 第4行，“銅綠假單胞菌”修訂為“大腸埃希菌” 第6行修訂為“其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量” 第7行，“按”修訂為“置”,理由（1） 根據(jù)5年來驗(yàn)證試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌對(duì)大部分抗生素不敏感，

23、而大腸埃希菌對(duì)抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。理由（2） 但是，銅綠假單胞菌作為自然環(huán)境中存在的假單胞菌族的代表也有其作為試驗(yàn)菌的必要性，無菌檢查法必須保證其能被檢出。所以采取了在培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)中保留銅綠假單孢菌，而在驗(yàn)證試驗(yàn)用菌和陽性對(duì)照用菌中改用大腸埃希菌。,2010版無菌檢查法修訂,16、附錄 105 頁，陰性對(duì)照 左第4行，“如果容器”修訂為“如果供試品容器” 左第5行，“向供試品容器內(nèi)導(dǎo)入”修訂為“向容器內(nèi)導(dǎo)入” 17、附錄 105 頁，薄膜過濾法 左第4行，增加“抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜” 左第11行，“每次沖洗量為100ml，且總沖洗量不宜過大，”修訂為“

24、每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不宜過大不得超過1000ml，” 理由：保證濾膜的完好性和微生物的存活。,2010年版微生物限度檢查法修訂,2010年版中國(guó)藥典微生物限度檢查法 附錄XIII C（一部） 附錄XI J （二部） 引入培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn) 增加白色念珠菌檢查法 貼膏劑檢查方法的改進(jìn) 限度標(biāo)準(zhǔn)表示方法改變,2010年版微生物限度檢查法修訂,4、附錄108頁，新增：貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）

25、的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，或以其他方法制備成供試液。,理由：與國(guó)際接軌。BP2007、EP6.0、USP30及美國(guó)、歐洲和日本三方協(xié)調(diào)一致的藥品微生物限度檢測(cè)方法，均對(duì)透皮貼劑規(guī)定了檢測(cè)方法和限度標(biāo)準(zhǔn)。,2010年版微生物限度檢查法修訂,5、附錄108頁，修訂：離心沉淀法 取一定量供試液，500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。 理由： 1、離心沉淀集菌法操作的不確定性較大，試驗(yàn)菌回收率的分布區(qū)間較寬。 2、離心集菌法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果復(fù)現(xiàn)性差，無法準(zhǔn)確反應(yīng)供試品受微生物污染的真實(shí)程度。 3、原操作規(guī)程中僅規(guī)定轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間不能很好的評(píng)價(jià)離心效果。（近年來更多的以相對(duì)離心力（R

26、CF）評(píng)價(jià)離心過程中的受力情況 。其計(jì)算公式為：RCF=0.00001118RN2 ，N表示轉(zhuǎn)速 ，R表示離心半徑 ）,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：取無菌10%葡糖糖溶液9ml置無菌離心管中（2管），分別加金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌菌液各1ml（5001500cfu/ml），按高速離心的條件試驗(yàn)，離心后，用無菌吸管從離心管上部小心吸出上清液（勿擾動(dòng)底部溶液），留底部集菌液約2ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨溶液補(bǔ)充至原量，混勻，取此供試液1ml注入平皿中，按平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定，計(jì)算回收率。,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)： 取無菌生理鹽水溶液9ml置無菌離心管中（2管），分別加白色念珠菌和枯草芽孢桿菌菌液各1ml（5001500c

27、fu/ml），混勻，按低速離心的條件試驗(yàn)，在離心管上部取樣1ml，按平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定，計(jì)算回收率,2010年版微生物限度檢查法修訂,6、附錄108頁，增加：計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。 菌種 驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）

28、26 003 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003,2010年版微生物限度檢查法修訂,6、附錄108頁，增加：計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu

29、的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35ml 含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。 菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)替代對(duì)應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。,計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株

30、試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48hr，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72hr，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72hr，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用對(duì)應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定 被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比大于70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)的適用性檢查符合規(guī)定。 被檢培養(yǎng)基菌落數(shù)瓊脂培養(yǎng)基回收率=

31、*100% 對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù),2010年版微生物限度檢查法修訂,13、附錄110頁，增加：控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。檢查項(xiàng)目包括培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)、指示和抑制特性能力。 菌種 對(duì)試驗(yàn)菌種的要求同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。 大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 09

32、4 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B） 64 941 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001,2010年版微生物限度檢查法修訂,16、附錄111頁，增加：白色念珠菌 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448 小時(shí)。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上

33、生長(zhǎng)的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。 若平板上生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。 芽管試驗(yàn)挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的

34、載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤(rùn)的平皿內(nèi)，置3537、13h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長(zhǎng)出短小芽管。 若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。,理由:白色念珠菌（Candida albicans），又稱為白假絲酵母菌（Saccharomyces albicaus），屬假絲酵母菌屬（Saccharom yces） 。白色念珠菌是條件致病菌，是醫(yī)學(xué)全身性真菌感染病的重要組成之一，一旦感染，常可引起心內(nèi)膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。 白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，目前國(guó)內(nèi)的藥品、食品標(biāo)準(zhǔn)均已把白色念珠菌作為微生物檢驗(yàn)中酵

35、母菌的代表菌，因此有些藥品依據(jù)給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。,(三) 微生物檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn),,無菌/微生物限度檢查理念,,,,,充分重視微生物檢查的重要性 充分重視微生物檢查方法的合理性 如何推進(jìn)微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展？ 方法驗(yàn)證,關(guān)于方法驗(yàn)證,為什么驗(yàn)證? 驗(yàn)證什么? 怎么驗(yàn)證? 何時(shí)驗(yàn)證？,關(guān)于方法驗(yàn)證,中國(guó)藥典2005版首次引入方法驗(yàn)證要求； 中國(guó)藥典2010版無菌檢查法和微生物限度檢查法延續(xù)了2005版方法驗(yàn)證要求； 中國(guó)藥典2010版微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則（一部附錄XVIII F、二部附錄XIX P）第五條。,為什么驗(yàn)證?,1、采用經(jīng)過驗(yàn)證的方法，是分析測(cè)量

36、科學(xué)的基本要求，是各種法規(guī)遵循工作的基礎(chǔ)。藥品微生物檢查作為整個(gè)藥品質(zhì)量體系中的一個(gè)環(huán)節(jié)，應(yīng)與其他檢驗(yàn)項(xiàng)目一樣，對(duì)方法和條件進(jìn)行考察，以保證結(jié)果的科學(xué)性，如鑒別、含量測(cè)定。 2、驗(yàn)證的思想其實(shí)早已貫徹于微生物檢測(cè)的諸多方面：無菌環(huán)境驗(yàn)證（塵埃離子、浮游菌、沉降菌檢測(cè)）、滅菌器的驗(yàn)證、培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè)、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照等等。,為什么驗(yàn)證?,3、2005版充分借鑒發(fā)達(dá)國(guó)家經(jīng)驗(yàn)，將微生物檢查方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了更加系統(tǒng)化的規(guī)定和要求。驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。 4、有了系統(tǒng)的方法驗(yàn)證，可以避免以往因?yàn)殛栃跃x擇不合理、方

37、法不合理而造成的漏檢、誤判，以保證結(jié)果的科學(xué)可靠，這一點(diǎn)無論對(duì)于當(dāng)前無菌檢查的一次性報(bào)告，還是對(duì)于實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證認(rèn)可、以及新的藥品注冊(cè)管理辦法的要求都是相一致的。,5、通過對(duì)同品種但不同批號(hào)或不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品的微生物學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)比較，可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品所用原料質(zhì)量或工藝流程中是否存在污染抑菌物質(zhì)的問題，具有藥品質(zhì)量控制的意義。,例：鹽酸利多卡因注射液,要求執(zhí)行驗(yàn)證的相關(guān)法規(guī)和文件,為了確保開展微生物學(xué)檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證，國(guó)食監(jiān)注2005234號(hào)“關(guān)于頒布和執(zhí)行中國(guó)藥典2005年版有關(guān)事宜的通知” 國(guó)藥典發(fā)200598號(hào)“關(guān)于執(zhí)行中國(guó)藥典2005年版微生物限度檢查法和無菌檢查法有關(guān)問題的說明”中檢藥20068

38、62號(hào)“第七屆全國(guó)藥品檢驗(yàn)所抗生素室主任工作會(huì)議暨全國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)研討會(huì)會(huì)議紀(jì)要”都作了說明和規(guī)定。,驗(yàn)證什么？,無菌、微生物限度檢查的驗(yàn)證試驗(yàn)可概括描述為：在采用的檢驗(yàn)方法和過程中，通過分別加入規(guī)定量的代表性微生物，以試驗(yàn)供試品是否在規(guī)定的檢驗(yàn)量、在所采用的檢驗(yàn)條件下無抑菌性，或已充分消除了抑菌性，并且所用方法對(duì)微生物生長(zhǎng)無不良影響，從而確認(rèn)檢驗(yàn)方法的有效性，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明，保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。按樣品的檢驗(yàn)流程，驗(yàn)證的重點(diǎn)環(huán)節(jié)分布如下：,驗(yàn)證什么？,需前處理,不需前處理,有抑菌作用,無抑菌作用,樣品,檢查,去除抑菌作

39、用,,,,,,,,,,,,,驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。,驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。,,可以通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判斷,藥品微生物檢查方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié),,,,驗(yàn)證什么？需要驗(yàn)證的重點(diǎn)環(huán)節(jié),驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。 前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)在驗(yàn)證范圍內(nèi)。已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程（SOP）和充足實(shí)驗(yàn)證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)疑問應(yīng)進(jìn)一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn)。尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗(yàn)證供試品本身對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。,怎么驗(yàn)證？,利

40、用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響，通過模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)降低或消除效果加以檢驗(yàn)。,稀釋法 薄膜法 中和法 離心法,供試品,前處理,去除抗菌活性,稀釋 溶解 分散 萃取 離心,,供試品污染微生物檢查,驗(yàn)證,,,,,,供試品中抗菌活性的去除,稀釋法降低供試品的相對(duì)濃度 薄膜法利用體積差異分離 中和法利用化學(xué)（生物）專屬性滅活 離心法利用沉降系數(shù)差異分離,各方法組合運(yùn)用，效果更佳！,抗菌活性去除效果的檢驗(yàn),應(yīng)根據(jù)供試品的特點(diǎn)，選擇敏感菌株，對(duì)供試品抗菌活性去除效果加以檢驗(yàn)，再按藥典要求全面驗(yàn)證，提高效率。,選擇敏感菌株,查閱資料臨床藥物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、文獻(xiàn)資料、申 報(bào)資料中的藥效學(xué)資料 參考已

41、經(jīng)驗(yàn)證過的品種 直接通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定,選擇適宜的方法,可靠、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便 參考方法： 在樣品許可的條件下 無菌：薄膜過濾，500ml/膜沖洗； 限度：薄膜過濾，300ml/膜沖洗。,結(jié)果總結(jié)與報(bào)告,綜合分析實(shí)驗(yàn)中遇到的所有情況，最終形成一份詳細(xì)、嚴(yán)謹(jǐn)、具有可操作性的驗(yàn)證報(bào)告。 給出該品種的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)規(guī)程，規(guī)程中應(yīng)明確樣品前處理步驟、采用的具體方法，以及各方法操作的關(guān)鍵點(diǎn)，以供檢驗(yàn)參考。 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)文件。,無菌檢查方法驗(yàn)證的思路,驗(yàn)證體系：陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn) 通過消除或抑制供試品中抗微生物物質(zhì)的活性來檢驗(yàn)微生物的方法，應(yīng)通過驗(yàn)證，以確定所用檢驗(yàn)方法測(cè)定結(jié)果的可信

42、度,無菌檢查方法驗(yàn)證的思路,利用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響，通過模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)降低或消除效果加以檢驗(yàn) 依據(jù)抗菌譜通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定敏感菌株（陽性對(duì)照菌） 通過敏感菌株確定沖洗量 通過方法驗(yàn)證驗(yàn)證該取樣量以及沖洗量下敏感菌株生長(zhǎng)情況 確定試驗(yàn)方案進(jìn)行檢驗(yàn),,,,影響無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果的環(huán)節(jié),供試液的制備 沖洗條件 中和劑的選擇與加入 敏感菌株的選擇與加入 標(biāo)準(zhǔn)化操作,影響無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果的環(huán)節(jié),供試液的制備供試液濃度過高增加了濾膜的初始吸附量，從而導(dǎo)致了后期沖洗體積的增大，因此將供試液濃度控制在一定范圍之內(nèi)有助于提高無菌檢查方法的科學(xué)性,供試液的影響,左奧硝唑注射液（水針）

43、 規(guī)格：10mL：0.25g/支 生產(chǎn)企業(yè) ： 衡陽恒生制藥有限公司 注射用鹽酸克林霉素（粉針） 規(guī)格： 0.3g/支 生產(chǎn)企業(yè) ：北京四環(huán)科寶制藥有限公司,左奧硝唑注射液（ 10mL：0.25g/支）,注射用鹽酸克林霉素（ 0.3g/支）,無菌三針單聯(lián)管 ----溶解稀釋供試品,,影響無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果的環(huán)節(jié),沖洗條件主要是沖洗體積對(duì)于無菌檢查方法的影響，沖洗體積過大濾膜的截留能力會(huì)降低，導(dǎo)致無菌檢查假陰性結(jié)果的出現(xiàn)建議沖洗量控制在1000ml/膜以內(nèi),沖洗量的影響性試驗(yàn),指征菌：粘質(zhì)沙雷（Serratiamarcescens） 注：又稱靈桿菌，一種產(chǎn)生鮮紅色素的細(xì)菌，存在于空氣和水

44、中，可生長(zhǎng)在動(dòng)、植物性食品中。為細(xì)菌中最小者，約0.5(0.51.0)微米。近球形短桿菌，但形態(tài)多樣。革蘭氏陰性，周身鞭毛,能運(yùn)動(dòng)。無莢膜，無芽胞，在普通瓊脂平板上2530培養(yǎng)12天出現(xiàn)粘性、中心顆粒狀、有惡臭的菌落。約半數(shù)菌株能產(chǎn)生紅色的靈菌素(prodigiosin)。在室溫條件下易促進(jìn)色素的生成，因本菌小且有色素，常用于檢定濾菌器的質(zhì)量。,操作步驟：1.濕潤(rùn)濾膜2.加入適量指征菌3.用不同沖洗量對(duì)濾膜進(jìn)行沖洗4.平行進(jìn)行陽性對(duì)照5.取膜培養(yǎng)6.計(jì)算回收率,沖洗量的影響性試驗(yàn),沖洗量的影響性試驗(yàn),影響無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果的環(huán)節(jié),中和劑的選擇與加入選擇：對(duì)應(yīng)的理化特性作為選擇依據(jù)，如內(nèi)酰胺酶

45、、 MnSO4 ；應(yīng)對(duì)微生物的生長(zhǎng)無影響。加入：不同中和劑加入方式效果不一樣。通過我們的經(jīng)驗(yàn)，基本傾向于直接加入培養(yǎng)體系中。,影響無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果的環(huán)節(jié),敏感菌株的選擇與加入選擇：根據(jù)抗菌譜和預(yù)試驗(yàn)（體外抑菌試驗(yàn)）加入：按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮濾器的有效性。而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽性菌生長(zhǎng)的影響，可以與對(duì)照濾筒比較而做出判斷，所以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與對(duì)照一致即可。,影響無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果的環(huán)節(jié),標(biāo)準(zhǔn)化操作供試液制備：通過比較發(fā)現(xiàn)，在檢驗(yàn)條件下，0.9%氯化鈉溶液對(duì)大多數(shù)的抗生素粉針比0.1蛋白胨溶液溶解能力強(qiáng)、溶解速度快。 沖洗方法

46、：少量多次、充分震搖、沖洗體積的控制中和劑和陽性對(duì)照菌的加入方式,樣品量以及供試液濃度的確定,出廠檢驗(yàn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上市抽驗(yàn)量，樣品量的增加是否會(huì)直接導(dǎo)致沖洗量的增加？ 沖洗只能讓樣品的吸附量降至最低值，即降至基礎(chǔ)吸附量 敏感菌的生長(zhǎng)取決于培養(yǎng)體系中殘留的濾膜基礎(chǔ)吸附量 濾膜基礎(chǔ)吸附量的多少取決于濾膜材質(zhì)，和沖洗量無關(guān),樣品量與基礎(chǔ)吸附量無關(guān),樣品量以及供試液濃度的確定,個(gè)論化描述時(shí)規(guī)定供試液濃度，不同取樣量參考規(guī)定濃度配制，所配供試液濃度不應(yīng)高于規(guī)定值。,微生物限度檢查方法驗(yàn)證的思路,選擇敏感菌株 選擇方法：同無菌驗(yàn)證 選擇參考： 一般中藥選擇枯草和金葡； 一般抗生素根據(jù)抗菌譜選擇。,原則:

47、由易到難，由簡(jiǎn)到繁,例：黃芩苷,黃芩苷： 理學(xué)性質(zhì)：幾乎不溶于水 查閱文獻(xiàn)： 周智興 傅穎媛 黃芩苷對(duì)白色念珠菌細(xì)胞周期的影響 結(jié)論 ： 黃芩苷具有明顯的抗白色念珠菌作用;黃芩苷能抑制白色念珠菌增殖 驗(yàn)證試驗(yàn)： 1：10供試液混懸，1ml影響菌落識(shí)別； 0.2ml/皿，0.1ml /皿，白念回收率明顯低于70%； 1：50供試液，澄清，薄膜過濾，300ml/膜；,選擇敏感菌株,,用藥典規(guī)定的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株，對(duì)124個(gè)中藥品種進(jìn)行驗(yàn)證，研究表明： 有一定抑菌作用和強(qiáng)抑菌作用的品種占總數(shù)的79%。 說明用在沒有對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證之前，有近80%的中成藥微生物限度檢查的結(jié)果，不能真實(shí)反映樣品中實(shí)際

48、的污染情況。,培養(yǎng)基稀釋法:定義? 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。 薄膜過濾法:供試液取樣量? 取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml 或10cm2 供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾；若供試品每1g、1ml 或10cm2 所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml 進(jìn)行試驗(yàn)。 四硫磺酸亮綠培養(yǎng)基:配法? 臨用前，取上述培養(yǎng)基，每10ml 加入碘試液0.2ml 和亮綠試液0.1ml，混勻。,什么時(shí)候驗(yàn)證？,（1）當(dāng)建立藥品的微生物學(xué)檢查方法時(shí)。即當(dāng)申報(bào)新藥時(shí)必須附有進(jìn)行微生物學(xué)檢查的方法學(xué)驗(yàn)證的資料。并在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的【無菌】或

49、【微生物限度】項(xiàng)下明確經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)確定的檢驗(yàn)操作方法。 （2）產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改時(shí)?？疾爝@些改變對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。,驗(yàn)證以后怎么辦？,無菌檢查：進(jìn)行供試品無菌檢查時(shí)，所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。,微生物限度：檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌酵母菌菌數(shù)的測(cè)定；供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行，增菌培養(yǎng)基的實(shí)際用量同控制菌檢查方法的驗(yàn)證。,檢驗(yàn)方法的各論化！,再驗(yàn)證定期再驗(yàn)證 考察驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)定性和及時(shí)發(fā)現(xiàn)影響微生物 生長(zhǎng)的因素。 與產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查同時(shí)進(jìn)行 陽性對(duì)照（無菌），敏感 菌回收（限度）,方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)工作的完善和發(fā)展,一方面以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為手段和契機(jī)，充分完善和細(xì)化我國(guó)無菌和微生物限度檢查方法，建立起完備的SOP體系。 另一方面集中力量盡快完成我國(guó)數(shù)以千計(jì)的品種的檢驗(yàn)方法的初步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并收集、整理、分析已有驗(yàn)證資料，指出各品種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的發(fā)展方向。 通過方法驗(yàn)證促進(jìn)我國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)工作全面發(fā)展。 微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則第五條。,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)信息交流平臺(tái) ,,謝謝大家！,,