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1、大豆蛋白的提取及與含量測定,在此處鍵入歡迎信息，長短均可。最好包括本站點(diǎn)的內(nèi)容簡介。,一、目的要求,1.學(xué)習(xí)掌握離心機(jī)、752N、天平的使用方法和注意事項(xiàng)； 2.學(xué)習(xí)掌握大豆蛋白的提取及制備丙酮干粉的原理和方法； 3 .學(xué)習(xí)計(jì)算蛋白質(zhì)收率,測定蛋白質(zhì)含量,二、實(shí)驗(yàn)原理（一）,1.大豆蛋白的等電點(diǎn)為4.5-5.0是酸性蛋白，盡管大豆中含有水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白和醇溶蛋白，但其主要成分為堿溶蛋白，本實(shí)驗(yàn)為節(jié)省丙酮用量只進(jìn)行堿提； 2.丙酮（有機(jī)溶劑）可降低溶液的介電常數(shù)、破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故可使蛋白質(zhì)在一定條件下沉淀析出；調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值到等電點(diǎn)附近，有利于蛋白質(zhì)的沉淀。,三、試劑、
2、材料及儀器,1. 0.2%的NaOH； 2. 6mol/L的HCl； 3. 1mol/L的HCl 4. 化學(xué)純級(jí)丙酮 5. 市售大豆粉 6. 精密pH 試紙 7. 天平 8. 離心機(jī)（普通） 9. 離心內(nèi)、外套管 10.燒杯 11.攪拌棒,四、實(shí)驗(yàn)步驟,提?。?稱取3克大豆粉，用0.2%NaOH 30毫升。（先加入調(diào)成糊狀，再用少量多次地慢慢地加入（邊加邊攪拌） NaOH溶液），室溫下攪拌抽提15min，于6000r/min離心7min ,小心留取上清液，棄脂層和沉淀，如上清液有漂浮物，再經(jīng)過濾； 留出上清液2毫升稀釋50、100倍做含量測定,三、實(shí)驗(yàn)步驟,制干粉：量上清液的體積，加入等體積在
3、冰箱中預(yù)冷的丙酮，先用6mol/L的HCl調(diào)pH至6.0，再用1mol/L的HCl小心調(diào)pH至4.5-5.0，于4000r/min離心15min，(留取沉淀物)，并用少量丙酮反復(fù)(至少兩次)攪拌洗滌（在離心管中進(jìn)行），加入丙酮后一定將沉淀攪拌充分，加入丙酮目的使沉淀脫水。得到白色粉末狀的大豆蛋白粉（上清液回收），用干凈的濾紙吸干、平鋪在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，再稱重并計(jì)算產(chǎn)率。,Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量,目的要求 掌握Folin酚法測定蛋白濃度的原理和方法實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)濃度可以從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如比重、紫外吸收，折射率等測定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲
4、反應(yīng)，F(xiàn)olin酚試劑反應(yīng)等方法來計(jì)算。其中雙縮脲法和Folin酚法是一般實(shí)驗(yàn)室中常用的方法，它們操作簡便，迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的儀器。Folin酚法靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍。 Folin酚法所用試劑是由兩部分組成，試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與蛋白質(zhì)中的肽鏈起顯色反應(yīng)。試劑乙中的磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下不穩(wěn)定，易被酚類還原而呈蘭色（鉬蘭和鎢蘭混合物）。,由于蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸還原呈蘭色，溶液蘭色的深淺與蛋白濃度有較好的線性關(guān)系。因此用Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量，靈敏度較高。 樣品中含酚類化合物及檸檬酸均有干擾作用，如果樣品酸度較高則顯色較淺，要提高碳酸鈉一氫氧化鈉的濃度。
5、此法也可測定溶液中酪氨酸的色氨酸的濃度。 Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一個(gè)，只是在各溶液的濃度及填加量上，保溫的溫度及保溫時(shí)間上有所不同而已，本實(shí)驗(yàn)所介紹的是本室常用的，靈敏度較高的操作方法。,試劑和器材,1、材料： 本實(shí)驗(yàn)所提取大豆蛋白水提取液，經(jīng)合適稀釋至可測定范圍。 2、試劑： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸緩沖液。 （2）200g/ml的標(biāo)準(zhǔn)酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin試劑甲：（俗稱堿性銅試劑）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 稱取0.5g酒石酸鉀鈉溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上兩溶液混合定
6、容到500ml，冰箱保存可用一個(gè)月。,(4)、Folin試劑乙：在2升磨口回流裝置的燒瓶內(nèi)，加鎢酸鈉（NaWO42H2O）100g，鉬酸鈉（NaMoO2M2O）25g，蒸餾水700ml，85%的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分混合后，小火回流10小時(shí)，再加硫酸鋰（Li2SO4）150g，蒸餾水50ml及數(shù)滴溴。然后開口沸騰15min，以驅(qū)除過量的溴，冷卻后定容到1000ml，過濾后呈金黃色，于棕色并中保存，可使用多年。 上述制備的Folin試劑乙的貯備液濃度一般在2mol/L左右，幾種操作方案都是把Folin試劑乙稀釋至1mol/L的酸度作為應(yīng)用液，我們是把貯備液于作用前稀釋18倍，使之濃
7、度為0.1mol/L略高。這種稀釋18倍后的Folin試劑乙就是下文稱之為應(yīng)用液，F(xiàn)olin試劑乙貯備液濃度的標(biāo)定，一般是以酚酞為指示劑，用Folin試劑乙去滴定1mol/L左右的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液，當(dāng)溶液顏色由紅變?yōu)樽匣疑?，再突然變成黑綠既為終點(diǎn)。如果用NaOH去滴定Folin乙，終點(diǎn)不太好掌握，溶液的顏色是由淺黃色變?yōu)闇\綠色，再變?yōu)榛易仙珵榻K點(diǎn)。,3、器材：,試管10支 試管架一個(gè) 移液管：（5ml、1ml） 移液管架 洗瓶 恒溫水浴 752N型分光光度計(jì),操作方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸緩沖液溶解的酪蛋白，濃度為200g/ml。用一支0.5ml移液管分
8、別取上述標(biāo)準(zhǔn)酪蛋溶液0ml, 0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml各加到一支試管中去，將此吸管用0.03mol/LPH7.8的磷酸緩沖液，反復(fù)洗凈，再用同一支移液管（防止未經(jīng)標(biāo)定吸量管的相對(duì)誤差的影響）取上述緩沖液將每支試管中的溶液補(bǔ)加至1ml。再在另一支試管中加入1ml緩沖液作空白對(duì)照。于上述試管中各加入1mlFolin試劑甲并不時(shí)地進(jìn)行振蕩，10min后再加入后1in試劑乙的應(yīng)用液4毫升。立既搖勻放入55水溶中保濕5min。取出后用自來水冷卻1min。于波長650nm進(jìn)行比色測定各管的OD值，以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，既可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。,Fo
9、lin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作：取7支試管（干燥的）按下表順序分別加入各種試劑并進(jìn)行反應(yīng)和測定,2、樣品測定：取兩支試管（平行）各加入待測的蛋白質(zhì)樣品液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲線（可取兩支試管編號(hào)8、9，與工作曲線同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)和比色測定）；,蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算： A650值對(duì)應(yīng)的mg數(shù)(Pr) Pr(mg/ml)= 稀釋倍數(shù) Pr溶液的ml數(shù),思考題 1、采用Folin的酚法測定樣品的蛋白質(zhì)含量時(shí)，樣品中的什么物質(zhì)對(duì)測定結(jié)果有干擾？ 2、作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白的酪蛋白在應(yīng)用時(shí)有何要求。,五、注意事項(xiàng),（一）使用離心機(jī)的方法及注意事項(xiàng)： 離心機(jī)的工作原理是：在離心力場的作用下，
10、可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度，從而將不同的物質(zhì)分離；離心機(jī)是生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用于提取、分離、純化的常用設(shè)備，其操作中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是平衡，具體的使用方法及注意事項(xiàng)如下（由在各室上課的教師結(jié)合本室離心機(jī)進(jìn)行現(xiàn)場指導(dǎo)）：,五、注意事項(xiàng)（離心機(jī)使用注意）,1.檢查離心內(nèi)、外套管應(yīng)完整不漏，洗凈離心管； 2.待離心的物質(zhì)裝入離心管的量不應(yīng)超過離心內(nèi)套管體積的2/3； 3.將一對(duì)離心管（含內(nèi)、外套管）放在臺(tái)秤上平衡，可調(diào)節(jié)離心管內(nèi)容物的量，也可在內(nèi)、外管間加水緩沖平衡； 4.檢查離心機(jī)可正常工作后，將一對(duì)平衡好的離心管按對(duì)稱的位置放在離心機(jī)中； 5.蓋好離心機(jī)蓋，打開電源開關(guān)，慢慢撥動(dòng)變速旋鈕（從0開始），使速度逐漸增加，記時(shí)，離心結(jié)束后，一定先將變速旋鈕慢慢撥到0位，再關(guān)電源；待離心機(jī)停止運(yùn)轉(zhuǎn)后，再打開離心機(jī)蓋，取出離心管，不許用手強(qiáng)行使離心機(jī)停止轉(zhuǎn)動(dòng)！ 6用完后，將內(nèi)外套管洗凈，倒立放置，使其干燥，并在使用的登記薄簽名。 7.使用過程中，如出現(xiàn)故障，一定請(qǐng)本室的實(shí)驗(yàn)員排除，不許擅自處理。,制丙酮干粉時(shí)的注意事項(xiàng),加入丙酮及加酸調(diào)pH時(shí)，都要邊 加邊攪 丙酮一定要遠(yuǎn)離明火 調(diào)pH時(shí)，不許調(diào)過頭. 制丙酮干粉，要少量多次加入丙酮后，將沉淀充分?jǐn)嚻稹?
大豆蛋白的提取及與含量測定.ppt
