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1、課題3 血紅蛋白的提取和分離,,血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。,一、基礎(chǔ)知識:,學(xué)生活動1:,1 、分離生物大分子的基本思路是什么？,2 、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？,3 、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進行提純？,4 、為什么不用雞的血紅細胞而用人的血紅細胞作為實驗材料？,5 、用什么方法分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì) ？,一、基礎(chǔ)知識--蛋白質(zhì)提取和分離原理,蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：,形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。,（1）
2、原理： （2）材料,大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快； 小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。,多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。,(一)凝膠色譜法,（3）分離過程,洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。,(一)凝膠色譜法,1、什么是凝膠？,2、什么是凝膠色譜法？,學(xué)生活動2:,3、凝膠色譜法的原理是什么？,4、請用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過程。,1 、什么是緩沖液？,2、 緩沖液的作用是什么？,學(xué)生活動3:,3、 緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過的人體 血液的緩沖物質(zhì)有哪些？,4、 本實驗加的是什么緩沖液？為何要加緩
3、沖液？,（二）、緩沖溶液,由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等,緩沖溶液洗脫劑 組成： 配制： 作用：,調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pH的緩沖液。,抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。,（二）、緩沖溶液,1 、什么是電泳？,2、 影響電泳遷移速度的因素有哪些？,學(xué)生活動4:,4、電泳分離各種分子的原理是什么？,（三）、電泳,3、 如何消除電荷對電泳遷移速度的影響？,5 、請描述電泳的過程？,2凝膠電泳法：,（1）原理：,不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋
4、白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。,影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素,(三)電泳,1.電泳的概念,指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.,影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素,,,,,,,,在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。,（2）分離方法： （3）分離過程：,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。,(三)電泳,電泳檢測結(jié)果,,,,二、實驗操作,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： （1）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。 （2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。 （3）
5、純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。 （4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。,（一）樣品處理,1、紅細胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。 2、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放 3、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。 4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。,二、實驗操作,跳轉(zhuǎn),血液組成成分,閱讀思考： 血液由______和________兩部分組成。 血細胞中________細胞數(shù)量最多，紅細胞的含量
6、最高的有機化合物是_____________。 該化合物是由 _____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的___________基團。,返回,1.洗 滌 紅 細 胞,閱讀思考：洗滌的目的是什么？ 洗滌過程：,血液 100mL,重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色,采集得到雞血,初次離心后的結(jié)果,3次洗滌后的結(jié)果,返回,2.釋放血紅蛋白,閱讀思考： 釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質(zhì)？ 為了加速釋放過程，采取了什么措施？,目的分析： 蒸餾水的作用是______________________________。 加入甲苯的作
7、用是____________________________。 充分攪拌的目的是____________________________。,使紅細胞大量吸水脹裂,溶解紅細胞的細胞膜,加速紅細胞的破裂,(2)血紅蛋白的釋放：,加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。,磁力攪拌器,返回,3.分離血紅蛋白,分離過程,紅細胞 混合液,,,,,,,,,,,燒杯,(3)分離血紅蛋白溶液：,過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。 試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層
8、（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。 分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。,甲苯層（無色透明）,白色薄層固體,紅色透明液體,雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）,試管中溶液層次,返回,4.透析血紅蛋白,利用透析袋透析,透析過程,返回,純化凝膠色譜操作,1.凝膠色譜柱的制作：,2.凝膠色譜柱的裝填：,教材圖519,3.樣品的加入和洗脫,,,返回,（二）凝膠色譜操作,（1）凝膠色譜柱的制作： 取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。 底塞的制作：
9、打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。 頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。 組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。 安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。,裝配好的凝膠柱,返回,材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液 裝填:,2.凝膠色譜柱的裝填：,立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h,洗滌平衡,一次性緩慢倒入；輕輕敲打,裝填懸浮液,凝膠顆粒洗脫液沸水浴,凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹,根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量,色譜柱垂直固定在支架上,配制懸浮液,計算稱
10、量凝膠,固定色譜柱,（2）凝膠色譜柱的裝填,凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。 凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果
11、。,洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。 注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,返回,3.樣品加入與洗脫,調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠
12、層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功） 注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,3.樣品的加入和洗脫,,,,3.樣品加入與洗脫,注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,收集得到的純化后的血紅蛋白,注意事項,1. 紅細胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過
13、少；低速、短時離心。 2. 凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡 3. 色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。 4. 色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。,,返回,觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、實驗結(jié)果分析與評價,1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成
14、功嗎？你是如何判斷的？,由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。,如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。,3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶
15、的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？,知識總結(jié),血紅蛋白的提取和分離,教學(xué)反饋,1凝膠色譜法是根據(jù)（ ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。 A分子的大小 B相對分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度 2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（ ）基本不變。 A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度,B,B,3電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（ ）的電極移動。 A相同 B相反 C相對 D相向 4. 哺乳動物和人的成熟的紅細胞中的（ ）與氧氣的運輸有關(guān)。 A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動蛋白 D肌球蛋白,B,A,5血液由血漿和各種血細胞組成，其中（
16、）的含量最多。 A白細胞 B血小板 C紅細胞 D淋巴細胞 6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉,C,D,7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（ ） A無色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物,C,1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是 A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能 C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程 D 獲得高純度的蛋白質(zhì),練習(xí)鞏固,2、用凝膠色譜法分離蛋
17、白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是 A 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) B 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) C 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) D 二者根本無法比較,3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于 A 電荷的多少 B 分子的大小 C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異 4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是 A 調(diào)節(jié)pH B 維持紅細胞的能量供應(yīng) C 防止微生物生長 D 防止血液凝固,5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的 O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是： 有機溶劑-----脂類物質(zhì)-----血紅蛋白溶液------紅細胞破碎物沉淀,
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