植物源花青素穩(wěn)定性和抗氧化活性研究分析生物技術專業(yè)

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1、 題 目 植物源花青素的穩(wěn)定性和抗氧化活性研究摘要所謂花青素，指的是在植物組織里存在的水溶性色彩。從界定范疇來說，花青素應該被納入類黃酮化合物領域。其本身無毒、使用安全，有突出的保健功效，尤其是抗氧化表現，近年來受到專家學者等的廣泛關注?；ㄇ嗨鼐邆涞母呖寡趸钚?，不僅可以有效的滿足人類延緩衰老需求，同時在自由基清除以及抗腫瘤等方面也有突出的作用發(fā)揮。所以無論是從醫(yī)療、化妝品研發(fā)以及食品加工等產業(yè)發(fā)展來說，花青素的應用前景十分看好。而且在研究的過程中，為更好的實現花青素的有效開發(fā)，本研究以藍莓提取物為植物源原料，對花青素的含量、穩(wěn)定性進行了研究。以自由基清除率的大小作為體外抗氧化能力強弱的評價指

2、標，驗證比較了藍莓花青素的抗氧化能力。本研究主要成果如下：（1）通過紫外可見光分光光度法確定藍莓提取物樣品的檢測波長為520nm，運用pH試差法測定本實驗樣品中的花青素含量為2.188mg/g。（2）藍莓花青素的穩(wěn)定性受室外日光影響較大10天后溶液顏色已消退至無色，花青素保存率只有12.65%。避光和室內自然光條件下溶液的吸光度值下降程度較小，顏色消退速率較慢，10天后花青素保存率仍超過60%。藍莓花青素在低于60的環(huán)境中穩(wěn)定性較好，60下水浴放置2h其花青素保留率可達93.8，但高溫環(huán)境下花青素保存率迅速下降，100時其保存率只有29.5?；ㄇ嗨厮釅A穩(wěn)定性受pH影響較大，溶液pH從1到10變

3、化時，溶液顏色變化過程為：紅色紫紅色淺紫色淺綠色綠色藍綠色。苯甲酸鈉對藍莓花青素穩(wěn)定性影響較小，抗壞血酸、亞硫酸氫鈉能增強藍莓花青素的穩(wěn)定性，且提高的效果與濃度有關。檸檬酸對藍莓花青素具有穩(wěn)定的增色作用。金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對花青素的穩(wěn)定性的影響相對較小，金屬離子Fe3+和Cu2+使得花青素溶液的顏色發(fā)生明顯改變，對花青素的穩(wěn)定性有顯著的影響。（3）在試驗操作上，使用的是三類氧化模型，分別是羥基以及DPPH自由基兩個模型，以及DPPH自由基模型等。在研究過程中，使用抗壞血酸、-生育酚、丁基羥基茴香醚（BHA）作為對照，通過比較它們對自由基的清除率表現，進而證實了在藍莓中提取

4、的花青素有突出的抗氧化表現?；谀Ｐ头治?，在采用超氧陰離子以及羥基自由基模型進行分析上，可知無論是花青素還是抗壞血酸，都有較為出色的自由基清除效果。在使用DPPH自由基模型分析時，通過研究，可知藍莓花青素、抗壞血酸、-生育酚、BHA對DPPH自由基IC50值分別為12.693ug/ml、15.478ug/ml、28.461ug/ml、79.469ug/ml，即對羥基自由基的清除能力的大小順序為：藍莓花青素抗壞血酸BHA一生育酚。關鍵詞：植物源 花青素 穩(wěn)定性 抗氧化活性AbstractAnthocyanin is a kind of water-soluble pigment which is

5、 widely present in plant tissue, and belongs to the flavonoid compound. Because of its safety, non-toxic and anti-oxidation and other health-care effects, it has been widely concerned by experts and scholars in recent years. Anthocyanin has high antioxidant activity, and has an important role in del

6、aying aging, scavenging free radicals, and resisting tumor, and has great application prospect in the fields of medicine, cosmetics, food processing and the like. In order to develop plant source anthocyanin, the content and stability of anthocyanin were studied by using blueberry extract as the raw

7、 material of plant. The anti-oxidation ability of blueberry anthocyanin was compared with the value of free radical clearance as the evaluation index of the anti-oxidation ability in vitro. The main results of this study are as follows: (1) the detection wavelength of the blueberry extract sample is

8、 determined to be 520 nm by the ultraviolet visible light spectrophotometry, and the content of the anthocyanin in the test sample is 2.188 mg/ g by using the pH test method. (2) The stability of the blueberry anthocyanin is affected by the outdoor sunlight for 10 days, the color of the solution is

9、resolved to be colorless, and the retention rate of the anthocyanin is only 12.65%. Under the condition of light and indoor natural light, the decrease of the absorbance of the solution is small, the color fading rate is slow, and the preservation rate of the anthocyanin is still more than 60% after

10、 10 days. The stability of anthocyanin in the environment was lower than 60 . The retention rate of anthocyanin was 93.8% in water bath at 60 , but the preservation rate of anthocyanin in high-temperature environment was decreased rapidly, and the preservation rate was only 29.5% at 100 . The stabil

11、ity of the acid-base of the anthocyanin is affected by the pH, and when the pH of the solution changes from 1 to 10, the color change process of the solution is as follows: red, purplish-red, light-purple, light-green, green and blue-green. The effect of sodium benzoate on the stability of the blueb

12、erry anthocyanin is small, and the ascorbic acid and the sodium bisulfite can enhance the stability of the blueberry anthocyanin, and the effect is related to the concentration. The citric acid has a stable color-increasing effect on the blueberry anthocyanin. The effect of metal ion Na +, K +, Ca 2

13、 + and Mg 2 + on the stability of anthocyanin was relatively small, and the metal ions Fe3 + and Cu2 + make the color of anthocyanin solution obviously change, and has a significant effect on the stability of anthocyanin. (3) Three anti-oxidation models of the superoxide anion system, the hydroxyl r

14、adical system and the DPPH free radical system were used in this test. The antioxidant capacity of the blueberry anthocyanin is further defined by comparing their clearance to the free radicals. In the superoxide anion and hydroxyl radical system, the scavenging ability of the anthocyanin and the as

15、corbic acid to the free radicals is obviously higher than that of the 1-tocopherol and the BHA. In the DPPH radical system, the IC50 values of blueberry anthocyanin, ascorbic acid, l-tocopherol and BHA on the DPPH radical were 12.693 ug/ ml, 15.478 ug/ ml, 28.461 ug/ ml and 79.469 ug/ ml respectivel

16、y.Key words: plant source; anthocyanidin; stability; antioxidant activity目錄摘要IABSTRACTII1緒論11.1花青素概述11.2花青素的定性定量方法21.3花青素穩(wěn)定性研究31.3.1PH影響31.3.2熱穩(wěn)定性31.3.3光穩(wěn)定性41.4花青素抗氧化活性研究41.4.1DPPH自由基清除率的測定41.4.2超氧陰離子清除能力測定41.4.3羥自由基清除能力測定51.5本研究的目的意義及研究內容51.5.1研究目的及意義51.5.2本實驗研究內容52植物源花青素穩(wěn)定性研究72.1實驗材料72.1.1主要實驗材料與試

17、劑72.1.2主要實驗儀器72.2實驗方法82.2.1花青素最大吸收波長的確定82.2.2pH試差法測定花色苷含量82.2.3光照對植物源花青素的影響82.2.4溫度對植物源花青素的影響92.2.5pH對植物源花青素的影響92.2.6添加劑對植物源花青素的影響92.2.7金屬離子對植物源花青素的影響92.3統計分析92.4結果與分析102.4.1花青素最大吸收波長的確定102.4.2pH試差法測定花色苷含量102.4.3光照對植物源花青素的影響102.4.4溫度對植物源花青素的影響122.4.5pH對植物源花青素的影響132.4.6不同食品添加劑對植物源花青素的影響132.4.7金屬離子對植物

18、源花青素的影響152.5小結153植物源花青素抗氧化活性研究173.1主要實驗試劑及儀器173.1.1主要實驗試劑173.1.2主要實驗儀器173.2試驗方法173.2.1清除超氧陰離子自由基分析方法173.2.2清除羥基自由基分析方法183.2.3清除DPPH自由基分析方法193.3統計分析193.4結果與分析193.4.1對超氧陰離子（O2）的清除作用193.4.2羥自由基(OH)清除作用203.4.3DPPH自由基清除作用223.5小結234結論與展望244.1結論244.2展望25參考文獻26致謝291 緒論1.1 花青素概述在植物中，花青素是一種非常關鍵的色彩，也正是因為花青素存在，

19、導致植物的花朵或果實會有紅色、藍色、黃色和紫色等，但自然條件下游離的花青素極少見，往往通過糖基化等過程形成花色苷。圖 1.1花青素架構布局示意圖花青素從屬性角度來說，應該是一種類黃酮類，在下圖1.1里對其基本結構做出了表述，為2 苯基苯并吡喃環(huán)。對于花青素而言，多數通常在、位存在羥基，同時對于位來說，會基于糖苷鍵模式實現與其它糖的結合。考慮到不同碳對應的取代基存在不同差異，所以花青素的類別也較多。結合研究結果，目前在自然界中，已經被發(fā)現的花青素類別就至少有500種以上。具體的類別和名稱在表1-1里做出了對應表述1，主要的花青素類別有天竺葵素、飛燕草素以及牽頭色素、矢車菊素、芍藥素等。表 1.1

20、自然界常見花青素名稱及取代基類別展示花青素的一個顯著特點是其穩(wěn)定性易受到影響。由于花青素中通常會有不同的化學物質存在，諸如甲基化、羥基數、以及糖類別及其連接位置差異等，導致花青素對植物的作用也會存在不同表現，致使植物會呈現出不同的色彩。由于位羥基化的作用影響，致使花色苷在具體的色彩表現上有不同的顏色出現。此外、位羥基化的作用在于確?；ㄉ沾嬖诘姆€(wěn)定性。此外對于位羥基化而言，在其影響下，會導致花色苷呈現出變黃的效果2。位以及位若出現花色苷甲基化，那么其會導致花色苷無法水解，因此其對花色苷的穩(wěn)定也有突出意義2。對于花色素而言，會有不同糖基取代反應發(fā)聲，通常發(fā)生位置是位3。此外在花青素里存在的單糖苷

21、，多數情況下應該為位連接糖基，此外二糖苷的連接主要是或是在、位分別進行1個連接。而三糖苷的連接為位以及位，分別連接的是2個糖基、1個糖基，也可能是在位進行3個糖基的連接4。糖基化對花青素的快速降解有一定的抑制作用?；ㄇ嗨仵；膶崿F基礎為糖基化。基于此，其能夠促使花青素有更高穩(wěn)定表現，一般來說帶芳香?；葞е；幕ㄉ沼懈怀龅姆€(wěn)定表現，多酰比單?；ㄉ辗€(wěn)定性突出，基于芳香?；淖饔糜绊懀瑫率够ㄉ粘尸F出藍色。但是對于脂酰化而言，基本上不會導致花色苷的顏色發(fā)生改變4?；ㄇ嗨氐牧硪粋€突出優(yōu)勢是有出色的抗氧化獲刑表現，主要是因為在其多酚里存在有較多的酚類羥基，而且酚羥基數量越多，則會導致分子量

22、隨之增加，其抗氧化表現也就更突出。對花青素分子來說，其含有的酚羥基能夠實現活性氧的去除操作，進而能夠實現態(tài)氧分子到基態(tài)氧原子的還原操作，致使氧自由基產生的概率下降5。1.2 花青素的定性定量方法在當前學術界對花青素進行定性分析實現上，有較多的分析對策，諸如紫外、紅外吸收光譜，紙、薄層層析以及核磁共振、現代技術質譜以及高效液相色譜等。在既有的定性研究方式運用上，其中對于紙層析與薄層層析方式來說，其是最早進行花青素定性研究的對策，是立足色彩完成花青素組成分析的方式。而且結合色帶的大小差異，也可以對花青素中不同成分的占比做出相應的判定。紫外可見吸收光譜法常用于花青素結構的初步鑒定。紅外吸收光譜法可以

23、確定分子官能團的特征。質譜的作用在于對分析的結構表現，以及分子量進行解讀。基于核磁共振方式進行分析，則可以實現化合物結構的清晰分析，其通?？梢越柚詈弦约拔灰瞥祦硗瓿煞治鲅芯俊Ｔ诙垦芯糠绞降倪\用上，結合學術界的研究現狀來說，多數學者認同可以借助花青素光學定律以及比爾定律來實現花青素的定量研究，主要的對策包括單一PH值或是PH示差等方式。在進行花青素里花色苷單體含量的測量分析上，一般采用高效液相色譜法完成。在對新鮮植物進行花青素提取量分析上，主要是運用單一PH值。這是因為在新鮮植物的花青素提取操作上，雜質本身不會影響到吸光度值。所以基于相應波長吸光度值的認定，就可以在界定的范疇里完成花青素含

24、量分析。若有干擾物質的存在，PH示差是一種有效的花青素含量分析方式。在實現上，只需在花青素最大吸收波長處獲取兩個值，同時強調其可以實現最大吸光度值差異，則可以完成花青素含量的計算分析。1.3 花青素穩(wěn)定性研究花青素在食品工業(yè)方面受到多重限制，這主要是因為它易受光照、溫度、pH因素影響而褪色或發(fā)生降解10，基于化學結構布局而言，花青素由于電子特性缺失，因此容易被自由電子或是活性氧基團攻擊進而降解9。1.3.1 PH影響由于PH 值改變，也會對花青素化學結構產生重要影響，導致其化學結構的變化11。若是在水溶液里，花青素存在的方式主要是有四類，分別是醌型堿、黃鹽陽離子、黃鹽陽離子以及假堿等。由于水溶

25、液PH 值的改變，以上形式也會有有可逆改變出現，因此這也會導致由于花青素結構改變，導致水溶液的色彩也會有相應的變化12。圖 1.2pH對花青素穩(wěn)定性的影響1.3.2 熱穩(wěn)定性一般情況下，花青素和其他天然色素可以在低溫下保存很長時間，隨著溫度的升高，其分子的內部運動加快，由于高溫因素的作用影響，導致花色苷位對應的糖苷結構發(fā)生變化，進而有熱降解情況出現13，由于溫度的上升的，導致花色苷去糖基化、進而發(fā)生裂解，獲取到酚酸、酚醛等14。而且在高溫作用下，水溶液里花色苷的結構也會發(fā)生變化，變?yōu)椴槎賶A結構，這種結構十分不穩(wěn)定。因此當溫度較高時，花青素會失去原有的色澤15。1.3.3 光穩(wěn)定性光照對花青

26、素穩(wěn)定性有一定的影響。謝程程等研究發(fā)現，在位，由于誘導作用影響，導致花青素碳骨架發(fā)生斷裂，進而催生羥基降解的中間產物，在相關作用影響下，這些產物經過氧化，變成查耳酮。在進一步氧化作用影響下，此時查耳酮可以生成苯甲酸或是三羥基苯甲醛等產物。也正是因為這些作用的存在，花青素會發(fā)生褪色現象18。所以這也就意味著在進行花青素存儲的過程中，盡可能是避光存儲。于文娟等在研究中發(fā)現，花青素穩(wěn)定性會受到室內散射光因素的影響，而且這種因素對其影響較大。其在研究中引入木棗果皮花青素進行實驗分析，證實了在經過長時間的散光照射后，果皮吸光度表現直線下降19。1.4 花青素抗氧化活性研究人們會將花青素看作是一種非常出色

27、的抗氧化劑?；诨ㄇ嗨氐氖褂茫梢詫崿F人體內多余自由基的清除，促使人體更好完成新陳代謝，同時也可以有效預防相應疾病。經過大量的研究結果可知，花青素有較為出色的自由基清除表現，這一點甚至比維生素、更為出色26，在抗氧化能力表現上，花青素分別是維生素、的20倍、50倍27。在進行體外的抗氧化活性檢測操作上，核心就是分析在進行DPPH以及羥自由基、超氧陰離子等方面的清除表現。1.4.1 DPPH自由基清除率的測定1，1二苯基2-苦肼基為基于氮為核心的穩(wěn)定自由基，其能夠在乙醇里進行溶解，溶解后獲取到紫色的溶液，可以實現517nm最大吸收波長。將自由基清除劑倒進DPPH溶液，此時在作用影響下，會出現孤對

28、電子配對的情況，因此也會削弱其吸收能力，最終導致溶液的色彩逐步變淺，或是色彩變黃。對于吸光度值的變化來說，一般其會和自由基清除的情況有較為緊密的線性關系。童丹等對馬鈴薯花青素的研究證實，花青素的抗氧化效果突出，而且有越高的花青素含量，在進行DPPH自由基清除方面的效果也就越突出28。張文彥等在對云南墨江紫米花青素進行研究時發(fā)現墨江紫米中花青素的濃度隨花青素濃度的增加而逐漸增加29。DPPH方法快速，簡便，靈敏，易于檢測，直接可行，該方法能直接作用于DPPH自由基且不受葡萄糖等外界因素的干擾，廣泛應用于抗氧化劑的研究。1.4.2 超氧陰離子清除能力測定若是處于堿性因素影響，那么此時基于鄰苯三酚的

29、氧化作用，會實現超氧化物陰離子的釋放，進而生成有色中間體，其有更為突出的吸光度表現。在其中進行氧化劑的加入，此時基于催化作用，會有過氧化氫生成，其不利于中間體生成，所以也會影響到吸光度值，導致其下降，從而也降低了鄰苯三酚自氧化速率。基于對待測物的吸光度值測定判斷待測物對超氧陰離子的清除水平。玄紅專運用鄰苯三酚自氧化法驗證了蜂膠、蜂花粉、蜂王漿、蜂蜜對超氧陰離子基均有較好的清除效果34。程德竹等設計實驗測定了生姜提取物對鄰苯三酚自氧化反應產生的超氧化物自由基的清除作用且清除率與提取液濃度呈線性關系35。1.4.3 羥自由基清除能力測定和鄰菲羅啉作用，則能夠獲取到紅色配合物。此時進的加入，則會有F

30、enton反應出現，即。生成的羥自由基可以對-鄰菲羅啉進行氧化，進而獲取到-鄰菲羅啉。在這種情況下，其吸光度也會對應下降，甚至不再有吸光度表現。基于抗氧化物質在加入，由于在抗氧化物質中會有活性組份存在，其通常會優(yōu)先與羥自由基進行反應，因此這也就會削弱自由基的氧化作用。Fenton 反應具有反應速度快、反應條件溫和、操作簡單方便、效率高、自動絮凝等優(yōu)點，具有廣泛的應用前景。丁利君等通過Fe2+催化H202氧化體系，發(fā)現在50-400ug/ml的范圍內黃芪提取物清除率與濃度劑量呈正相關36。黃鎖義等參照Fenton反應的方法建立了一個反應體系模型，測定了茉莉花莖總黃酮對羥基自由基的強清除作用37。

31、1.5 本研究的目的意義及研究內容1.5.1 研究目的及意義隨著消費者保健安全意識的提升，開發(fā)和研究食用天然色素已成為當今的探討熱點?；ㄇ嗨刈鳛樘烊簧氐囊环N，植物源頭豐富，具有的較高的抗氧化活性及健康促進作用，專家學者們對花青素的開發(fā)應用都給予了廣泛關注。在研究中發(fā)現目前花青素的穩(wěn)定性是制約它應用生產的主要原因，花青素在加工或保存環(huán)境的pH、溫度、光照、氧濃度等外界條件的作用下，易解離，褐變或褪色，溶液原有的顏色和透明度也可能發(fā)生改變，同時花青素的穩(wěn)定性也影響著它的抗氧化性和生物可利用度。結合學術界的研究來說，在進行花青素研究上，學者更關注的是其提取，以及如何采用技術手段實現純化，關于花青素

32、的穩(wěn)定性探討，既有的研究主要是從光照、溫度、pH等因素觸發(fā)分析，抗氧化性的研究多關注紫薯、葡萄等植物源。本研究旨在設計實驗探討多種食品添加劑、金屬離子等外在因素對植物源花青素的影響，并運用多種抗氧化活性指標驗證評價花青素的抗氧化能力，為花青素在食品、醫(yī)療、美容等行業(yè)的應用和發(fā)展提供理論依據。1.5.2 本實驗研究內容（1）花青素最大吸收波長的確定。本實驗選用植物源性較強的藍莓提取物作為研究材料，采用紫外分光光度法確定其最大吸收波長。（2）花青素的定量分析。利用pH試差法，通過實驗測定在花青素的最大吸收波長處的兩個吸光度值，據公式計算出花青素的總量。（3）花青素的穩(wěn)定性研究。研究溫度，pH值，光

33、照，Na+、K+、Ga2+、Fe3+、Mg2+、Cu2+六種金屬離子以及維生素C、檸檬酸、苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉等添加劑可能給藍莓花青素帶來的影響作用，進而實現確保花青素穩(wěn)定條件的研究分析。（4）花青素抗氧化活性的研究。通過比較植物源花青素、抗壞血酸、-生育酚、丁基羥基茴香醚在不同自由基清除方面的效果，就植物花青素的抗氧化表現展開論述。2 植物源花青素穩(wěn)定性研究由于花青素缺少一個電子而具有一定的還原能力，易受到若干因素產生的活性氧基團或自由電予攻擊而失去還原能力，如pH、溫度、化學結構、光、氧化還原劑、金屬離子等。本實驗通過紫外可見光分光光度法確定藍莓花青素的最大吸收波長, 用pH試差法測定藍莓

34、樣品的花色苷含量。分別設計實驗研究了光照，溫度，pH值，維生素C、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、苯甲酸鈉等添加劑及離子在藍莓花青素穩(wěn)定性表現方面的作用。2.1 實驗材料2.1.1 主要實驗材料與試劑表 2.1主要實驗材料與試劑2.1.2 主要實驗儀器表 2.2主要實驗儀器名稱型號生產廠家超純水儀電子天平ATY124菲律賓制造pH計紫外可見光分光光度計T6新世紀北京普析通用儀器有限公司HH系列數顯恒溫水浴鍋HH-2金壇市科析儀器有限公司2.2 實驗方法2.2.1 花青素最大吸收波長的確定稱取1.00克藍莓提取物，充分溶解，而后將其放置到100ml容量瓶里，定容。隨后從中進行適度溶液提取，基于紫外可見光分光

35、光度計來進行該提取溶液在450600 nm區(qū)間吸收光譜分析，進而實現對最大吸收波長的界定。2.2.2 PH試差法測定花色苷含量緩沖溶液的配置pH=1.0緩沖液：將0.2mol和0.2mol進行混合，二者的比例是2567。緩沖液：實現1、1以及進行混合，比例是。pH示差法測定藍莓花色苷的含量用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液將2ml藍莓提取物溶液稀釋至10 ml具塞試管中，振蕩搖勻，避光平衡90分鐘。利用花色苷的結構特性：在pH1.0的環(huán)境中在520nm波長下有特征吸收，但是在pH4.5的情況下，此時花色苷存在結構變黃的情況，變化后變成了五色的物質，且520nm無吸收峰，溶液里的其他共存的有機

36、酸類、黃酮類、多酚類等干擾物質不會隨pH的改變而發(fā)生變化。因此通過測得兩個pH下的吸光值差，即可確定花色苷的含量。藍莓花色苷含量計算公式為：C（mgg-1）=（A0-A1）VnM/（m）（濕重） （2.1）其中，A0、A1分別代表的是在PH分別是1.0、4.5情況下，花色苷吸光度值情況。提取液的體積是V，稀釋的倍數為n，同時M、分別代表的是Cy-3-Glu相對分子質量、消光系數，取值分別是449.2、26900。樣品的質量用m表述。2.2.3 光照對植物源花青素的影響稱取3份1.00克藍莓提取物,溶解定容至100ml容量瓶中，分別置于室外日光、室內自然光、室內避光的條件下，自然放置10天，每隔

37、兩天采樣一次，觀察其顏色變化并在最大吸收波長處測量吸光度。2.2.4 溫度對植物源花青素的影響取1000ml已配制好的植物源花青素溶液6份于具塞試管，密封并分別在40100范圍內設置6個梯度實驗，每升高10為一個梯度，將花青素溶液在水浴恒溫鍋中恒溫加熱兩小時，選擇最大吸收波長完成吸光度的測定分析。而后對色素保存率R進行計算： （2.2） 其中，Ao、A分別代表的是初始以及樣液吸光度。2.2.5 pH對植物源花青素的影響取100ml已配制的植物源花青素溶液10份于具塞試管，分別使用1mol/LHC1或NaOH溶液進行pH的調節(jié)，使pH在1l0的范圍內進行梯度實驗，每相差一個pH值為一個梯度，密封

38、靜置十二小時，取樣在最大吸收波長處測定吸光度并觀察其顏色變化。2.2.6 添加劑對植物源花青素的影響各取100ml已配制好的植物源花青素溶液于具塞試管，分別將濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、檸檬酸、苯甲酸鈉溶液1ml添加進具塞試管，密封靜置兩小時，取樣在最大吸收波長處測定吸光度。2.2.7 金屬離子對植物源花青素的影響各取100ml已配制好的植物源花青素溶液于具塞試管，分別將濃度為001mol/L的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、三氯化鐵、氯化鎂、硫酸銅溶液1ml添加進具塞試管，室溫下放置半小時，選擇最大吸收波長完成吸光度的測定分析。2.3 統計分析基于E

39、xcel完成試驗結果的處理和研究，在進行數據的呈現上，基于均數標準差描述，要對每個數據進行3次的重復處理操作。2.4 結果與分析2.4.1 花青素最大吸收波長的確定圖 2.1花青素最大吸收波長本實驗選擇在450600nm的可見光條件下測定藍莓花青素的最大吸收波長。由圖 2.1可知藍莓花青素在450600nm范圍內，所測得的吸光度值先增大后減小，在500550nm范圍內出現最大值，這與田喜強38劉妍39等人對多種植物源花青素的研究結果一致。分析可知本藍莓提取物樣品最大吸收峰處的波長為520nm，因此可選擇520nm作為檢測波長。2.4.2 pH試差法測定花色苷含量表 2.3花色苷含量測定結果序號

40、吸光度值花色苷含量mg/g平均花色苷含量mg/gA0A110.2920.0302.1882.18820.2910.0302.17930.2910.0282.196在進行實驗操作的過程中，對藍莓花青素溶液520nm處吸光度值的測定，主要采用的是紫外可見分光光度計，由表 2.3花色苷含量測定可知，通過測得的兩個pH下的吸光值差，計算得出本藍莓提取物樣品的花色苷含量為2.188mg/g，略高于胡雅馨40等所研究的藍莓花青素含量范圍，原因可能是研究的藍莓品種存在差異。2.4.3 光照對植物源花青素的影響表 2.4光照對花青素的影響時間/天室外日光室內自然光室內避光A0A保存率%A1A保存率%A2A保存

41、率%00.2450.24198.370.2410.23898.430.2420.24099.1720.20884.900.22793.880.23195.4540.15764.080.20685.190.22392.1560.11647.350.18777.340.21588.8480.06325.710.17271.130.20785.54100.03112.650.15363.280.19279.34表 2.5花青素溶液的色彩變化情況分析時間/天樣液顏色室外日光室內自然光室內避光0紫色紫色紫色2紅色紫色紫色4淺紅紅色紫紅6淺紅紅色紫紅8無色淺紅紅色10無色淺紅紅色圖 2.2花青素保存率實驗

42、結果表明，在不同的光照條件下，藍莓花青素的吸光度不同，均呈不同程度的下降，其中避光和室內自然光的吸光避光條件下，10天后藍莓花青素的保存率可接近80，顏色仍可保持為紅色。室內自然光條件下，10天后藍莓花青素的保存率可超過60，顏色可保持為淺紅色。室外日光對藍莓花青素的穩(wěn)定性影響較顯著，6天后藍莓花青素的保存率只有47.35，10天后顏色已消退呈無色。結果表明室外日光對藍莓花青素的穩(wěn)定性影響較大，出現這種現象的原因可能是長期高能量的光照使藍莓花青素因被氧化而降解，生成C4羥基的中間產物并繼續(xù)在C2位上被水解，最終導致查耳酮的生成，查爾酮可以實現再次分解，進而獲取到苯甲酸，以及三羥基苯甲醛，進而會

43、影響到色彩的變化。所以要求在進行花青素存儲上盡量避光。2.4.4 溫度對植物源花青素的影響表 2.6溫度對花青素的影響溫度A0A保存率%400.242 0.235 97.1 500.238 0.230 96.6 600.240 0.225 93.8 700.240 0.160 66.7 800.239 0.116 48.5 1000.241 0.071 29.5 圖 2.3花青素保存率溫度對藍莓花青素的穩(wěn)定性影響如圖 2.3所示。藍莓花青素在低溫下有較好的穩(wěn)定性，在4060范圍內保存率較高，楊艷17等在對黑蘿卜花青素進行研究時同樣發(fā)現隨著時間的延長，在40和60下放置的黑蘿卜花青素的保存率沒有

44、明顯變化。本試驗中40以下放置2h藍莓花青素的保存率可達97.11，60下放置2h其保存率可達93.8，80時其保存率為48.5，100時其保存率只有29.5。這是由于高溫可加快分子運動，花青素的結構與功能被破壞的速度也加快，使得藍莓花青素的穩(wěn)定性變差。隨著溫度的升高，其分子的內部運動加快，導致花色苷位對應的糖苷結構發(fā)生變化，進而有熱降解情況出現13，由于溫度的上升的，導致花色苷去糖基化、進而發(fā)生裂解，獲取到酚酸、酚醛等14。而且在高溫作用下，水溶液里花色苷的結構也會發(fā)生變化，變?yōu)椴槎賶A結構，這種結構十分不穩(wěn)定。2.4.5 pH對植物源花青素的影響表 2.7pH對花青素的影響PH吸光值顏色

45、10.316紅色20.289紅色30.273紅色40.251紫紅50.221淺紫色60.217淺紫色70.210淺紫色80.233淺綠色90.261綠色100.314藍綠pH對藍莓花青素影響很大。當pH在13時，花青素溶液顯紅色；當pH為4時，藍莓花青素溶液顏色變淺。pH在57時，花青素溶液褪色的現象愈加明顯，已然從酸性條件下的紅色變成了淺紫色，在pH7時達到吸光度的最小值。pH值為8時，溶液開始顯現為綠色，當溶液pH為10呈強堿性時，顏色加深變?yōu)樗{綠色。實驗結果表明藍莓花青素的空間結構可能在強酸強堿的條件下發(fā)生變化，從而使溶液顏色產生變化。婁文娟41等在研究紫薯花青素時發(fā)現花青素的保存率在p

46、H為15范圍時下降并不明顯，隨著pH的繼續(xù)升高，花青素的損失率急劇增大，而當pH為11時，花青素的損失率高達84.6%，表明花青素在堿性條件會下迅速分解。2.4.6 食品添加劑對植物源花青素的影響表 2.8添加劑對花青素影響分析濃度%吸光度值亞硫酸氫鈉苯甲酸鈉檸檬酸抗壞血酸0.00 0.2360.2360.2360.2360.20 0.315 0.281 0.260 0.298 0.40 0.334 0.270 0.275 0.304 0.60 0.351 0.251 0.296 0.319 0.80 0.271 0.247 0.298 0.269 1.00 0.234 0.229 0.323

47、 0.245 圖 2.4添加劑對花青素的影響結果表明，抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、苯甲酸鈉、檸檬酸四種不同的食品添加劑對藍莓花青素的穩(wěn)定性都有一定的影響。由圖 2.4分析比較可知，加入的亞硫酸氫鈉溶液的濃度在0.6%以下時，花青素的吸光度為增加趨勢，但當亞硫酸氫鈉的濃度提高到0.6%以上時，出現了顯著的下降趨勢，原因可能是亞硫酸氫鈉與藍莓花青素之間進行加成反應生成了穩(wěn)定的無色化合物。添加抗壞血酸后，花青素溶液的吸光度出現了和亞硫酸氫鈉加入后的相同變化趨勢，但吸光度的增強效果不如亞硫酸氫鈉，這是因為由于存在較多的抗壞血酸，因此在降解過程中，其生成的過氧化物直接氧化藍莓花青素，進而導致二者均被降解。苯甲

48、酸鈉對花青素吸光度的影響不顯著，濃度為1%時的溶液吸光度與未添加時溶液吸光度差異不大。檸檬酸溶液在所配置的濃度范圍內是花青素溶液的吸光度值升高，存在一定的增色效應，這可能是因為檸檬酸作為酸味劑，可以降低溶液的pH值，有利確?；ㄇ嗨赜懈叩姆€(wěn)定表現。2.4.7 金屬離子對植物源花青素的影響表 2.9金屬離子對花青素影響研究離子類別未添加Na+K+Ca2+Fe3+Mg2+Cu2+吸光度值0.2320.2270.2310.2210.3840.2190.271顏色紫紅色紫紅色紫紅色紫紅色黑紫色紫紅色紫色圖 2.5不同金屬離子對花青素的影響結合圖 2.5的結果，證實了等對花青素的穩(wěn)定性影響表現不大，所以

49、在完成添加后溶液顏色沒有變化。溶液受金屬離子Fe3+和Cu2+的影響，發(fā)生了明顯改變，由紫紅色變?yōu)楹谧仙蜃仙?，說明藍莓花青素的穩(wěn)定性受到了Fe3+和Cu2+的顯著的影響。造成這一現象的原因可能是藍莓花青素B環(huán)上的鄰位羥基與Fe3+和Cu2+反應生成了深色絡合物。2.5 小結藍莓花青素的穩(wěn)定性受光照影響較大，長時間的光照會加速花青素的破壞速率，加快降解過程，從而導致顏色消退。藍莓花青素溶液的顏色隨著pH變化而變化，由紅色到紫色再到藍綠色，實驗結果表明花青素在酸性條件下更穩(wěn)定。藍莓花青素穩(wěn)定性易受溫度影響，在4060時較穩(wěn)定，而在80時花青素的保存率明顯下降。所以高溫、長時間光照以及堿性環(huán)境均不

50、利于花青素的保存。抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、苯甲酸鈉、檸檬酸四種添加劑對藍莓花青素的穩(wěn)定性都有一定的影響。通過對四種不同食品添加劑的研究比較發(fā)現苯甲酸鈉對藍莓花青素穩(wěn)定性影響較??；抗壞血酸、亞硫酸氫鈉能在一定程度上提高藍莓花青素的穩(wěn)定性，且存在一定的量效關系。檸檬酸則對藍莓花青素具有增色效應。金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對花青素溶液的穩(wěn)定性影響不明顯，而Fe3+、Cu2+等則會破壞花青素穩(wěn)定性。3 植物源花青素抗氧化活性研究從花青素的結構可以看出，它具有大量的酚羥基官能團，有很強的抗氧化活性， 本研究以藍莓提取物為實驗原材料，對其體外抗氧化活性做出論述。在進行研究上主要是結合藍莓花青素

51、在DPPH、羥基自由基以及超氧陰離子等方面的表現等展開論述。3.1 主要實驗試劑及儀器3.1.1 主要實驗試劑表 3.1主要實驗試劑3.1.2 主要實驗儀器表 3.2 試驗過程中主要使用的儀器3.2 試驗方法3.2.1 清除超氧陰離子自由基分析方法溶液配制1）0.1mol/L HCL溶液：將4.2ml濃鹽酸放入500ml容量瓶并用超純水溶解定容。2）0.1mol/L Tris溶液：將三羥甲基氨基甲烷1.2114g放入100ml容量瓶并用超純水溶解定容。3）0.05mol/L Ph8.2的Tris-HCL溶液：量取50ml0.1mol/L Tris以及22.9ml0.1mol/L HCL溶兩種溶

52、液，在充分混合后，加入100ml容量瓶并用超純水溶解定容。4）0.01mol/L HCL溶液：取已配制好的0.1mol/L HCL溶液進行10倍稀釋操作。5）25mmol/L鄰苯三酚溶液：將0.1576g鄰苯三酚放入50ml棕色容量瓶加入0.01mol/L HCL溶液，使其充分溶解，而后進行25水浴。6）8mol/LHCL溶液：將4.2ml濃鹽酸放入100ml容量瓶并用超純水定容。實驗操作步驟選擇0.05mol/LpH82的TrisHCI緩沖溶液45m1，在25進行恒溫水浴20分鐘。進行1ml樣品以及05ml25mmol/L鄰苯三酚溶液混合，在25進行恒溫水浴5分鐘。隨后在其中加入8mol/L

53、HC1溶液1ml停止反應。參比是TrisHCI緩沖溶液，空白對照組是超純水，對照組是抗壞血酸、-生育酚、丁基羥基茴香醚，重復進行3次試驗操作。用T6型紫外可見光分光光度計完成425nm處吸光度測定，進行3次測試結果的平均值求取，進而實現清除率的計算。超氧陰離子自由基清除率(%)= （3.1）A0、A分別是空白以及樣品或是對照品對應的平均吸光度。3.2.2 清除羥基自由基分析方法溶液配制1）溶液：將0.2502g七水硫酸亞鐵放入100ml容量瓶并用超純水溶解定容。2）水楊酸一乙醇溶液：將0.1243g水楊酸放入100ml容量瓶并用無水乙醇溶解定容。3) 溶液：將0.1ml 30%過氧化氫放入10

54、0ml容量瓶并用超純水溶解定容。實驗操作步驟分別在試管里加入9mmol/LFeSO4溶液、水楊酸一乙醇溶液、樣品溶液、各1ml，選擇37進行恒溫水浴半小時。參比是雙蒸水，空白對照組是超純水，對照組是抗壞血酸、-生育酚、丁基羥基茴香醚，重復進行3次試驗操作。使用T6型紫外可見光分光光度計完成510nm處吸光度測定，進行3次測試結果的平均值求取，進而實現清除率的計算。羥基自由基的清除率(%)= （3.2） A0、A分別是空白以及樣品對應的平均吸光度。3.2.3 清除DPPH自由基分析方法溶液配制004mg/mlDPPH溶液：選擇0.0020g DPPH，而后將其在乙醇里進行充分溶解，選擇50ml棕

55、色容量瓶對完成溶解的溶液進行定容。實驗操作步驟在試管里進行0.04mg/mlDPP以及樣品溶液分別2ml?？瞻捉M是0.04mg/mlDPP以及超純水分別是2ml。對照組在樣品溶液的使用上，分別是抗壞血酸、-生育酚、丁基羥基茴香醚。進行3次重復的試驗操作，并完成實驗數據的記錄，分別進行517nm處吸光度測量。則其在DPPH清除率方面表現計算公式為： DPPH的清除率(%)=1(Ai一Aj)/Ac100 （3.3）Ai、Aj以及Aj分別是DPPH+待測溶液、測溶液+溶劑以及DPPH溶液+溶劑分別對應的的吸光度值。3.3 統計分析基于Excel、SPSS Statistics V22.0完成試驗數據

56、處理和研究，在進行數據的呈現上，基于均數標準差描述，要對每個數據進行3次的重復處理操作。3.4 結果與分析3.4.1 對超氧陰離子（O2）清除作用圖 3.1對超氧陰離子清除作用若有過涼的超氧陰離子自由基存在，容易導致脂質過氧化情況出現，甚至在細胞內造成DNA損傷42，所以進行超氧陰離子自由基清除的價值十分突出。結合圖3.1的結果，藍莓花青素、抗壞血酸、BHA都可對O2進行清除作用，且隨著濃度的升高，清除率逐漸増大。藍莓花青素和抗壞血酸清除O2的能力明顯高于BHA?？箟难嵩谳^低的質量濃度時，表現出較好的清除效果。在100ug/ml時，抗壞血酸對O2的清除率可達到35%左右，而藍莓花青素僅為25

57、%。但若是濃度為4000ug/ml，則其清除能力十分突出，要比抗壞血酸高。程錚等在研究紫甘薯花青素的抗氧化活性時同樣發(fā)現花青素有較低濃度的情況下，在自由基清除方面效果不及抗壞血酸。但是若其濃度超出0.23mg/ml，則有較為出色自由基清除表現，效果要比抗壞血酸顯著高出不少43。3.4.2 羥自由基(OH)清除作用圖 3.2對羥基自由基的清除作用圖 3.3對羥基自由基清除作用通過結果研究，藍莓花青素、丁基羥基茴香醚、抗壞血酸、-生育酚均表現出一定的對OH的清除能力，且隨著加入的抗氧化劑濃度的升高，清除率出現增大趨勢，呈現一定的量效關系。藍莓花青素和抗壞血酸對OH的清除能力明顯高于丁基羥基茴香醚與

58、-生育酚。使用SPSS Statistics V22.0軟件進行數據結果的的研究，在進行50%羥基自由基清除表現上，藍莓花青素、抗壞血酸對應的IC50值分別是0.075mg/ml、0.219mg/ml，因此在清除能力表現上，藍莓花青素更突出。若是0.01mg/ml濃度，此時花青素在自由基清除上可以實現60%的清除效率，而抗壞血酸對羥基自由基的清除率不足20%。本實驗結果表明對羥基自由基的清除能力的大小順序為：藍莓花青素抗壞血酸BHA一生育酚?？箟难犭m也具備一定的清除能力，但自氧化過程生成的過氧化氫會促進Fenton反應中OH的生成，因此清除能力相對較弱。3.4.3 DPPH自由基清除作用圖

59、3.4對DPPH自由基的清除作用圖 3.5DPPH自由基清除作用結合上圖圖 3.4圖 3.5，主要是就花青素、抗壞血酸、-生育酚以及丁基羥基茴香醚在自由基清除方面的效果表現做出了分析和論述，基于試驗可知，四種物質均可以完成自由基清除，其中花青素和抗壞血酸清除DPPH自由基效果要比-生育酚、丁基羥基茴香醚更突出，優(yōu)勢十分明顯。其中在自由基清除上，丁基羥基茴香醚效果最不理想?；赟PSS Statistics V22.0對數據結果進行研究，進而能夠獲取藍莓花青素、抗壞血酸、一生育酚、丁基羥基茴香醚對DPPH自由基的清除率達到50%時的IC50值分別為12.693ug/ml、15.478ug/ml、

60、28.461ug/ml、79.469ug/ml。濃度大于50ug/ml時，花青素和抗壞血酸的幾乎可以完全清除DPPH自由基，總體差異不明顯。3.5 小結在這部分的試驗分析上，使用的是三類氧化模型，分別是羥基以及DPPH自由基兩個模型，以及DPPH自由基模型等，鑒定了藍莓花青素具有強大的抗氧化活性，并對比了藍莓花青素、抗壞血酸、-生育酚、丁基羥基茴香醚在各體系中的抗氧化能力大小。藍莓花青素在3個不同抗氧化體系中都表現出清除能力，藍莓花青素濃度越大，抗氧化活性越強。在清除超氧陰離子的體系中，花青素與抗壞血酸對O2-的清除能力明顯高于丁基羥基茴香醚。濃度較低時，抗壞血酸的清除表現要比藍莓花青素略微出

61、色。但是在濃度是400ug/ml情況下，此時藍莓花青素的自由基清除表現更為出色。對于羥基自由基而言，藍莓花青素、抗壞血酸在自由基清除方面的效果要顯著高于丁基羥基茴香醚與-生育酚?；谧杂苫宄哪芰母叩降瓦M行排序，應該是：藍莓花青素抗壞血酸丁基羥基茴香醚-生育酚。在清除DPPH自由基的體系中，藍莓花青素和抗壞血酸仍體現出較高的羥基自由基的清除能力。4 結論與展望4.1 結論近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對花青素類安全性高，擁有多種生理活性的天然產物及其衍生產品的要求也越來越高。本文以藍莓提取物為研究對象對其中花青素含量情況做出了研究，同時海分析了花青素的穩(wěn)定性表現，并就藍莓提取物抗氧化作用進行了探討，得出以下主要結論：（1）本研究通過紫外可見光分光光度法在 450600nm的可見光條件下測定藍莓花青素的最大吸收波長為520nm，由此確定了針對本實驗中藍莓提取物樣品的檢測波長為520nm。（2）本研究使用T6型紫