蛋白質(zhì)工程 作業(yè)答案

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1、第三章 蛋白質(zhì)工程 習(xí)題 1、名詞解釋:蛋白質(zhì)工程:是基于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的認識,進行分子設(shè)計,通過基因工程途徑定向地改造蛋白質(zhì)或創(chuàng)造合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)的理論及實踐,是基因工程基礎(chǔ)上的延伸,是第二代基因工程。 蛋白質(zhì)分子設(shè)計:是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計方案,即在知道了需要改造的蛋白質(zhì)的性能及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之后,通過理論的方法,提出蛋白質(zhì)改造的設(shè)計方案。 嵌合抗體:用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū))基因與人免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)(C區(qū) )基因相連接,構(gòu)建成嵌合基因,導(dǎo)入宿主細胞進行表達,制成嵌合抗體。目前國內(nèi)外已制備了數(shù)十種嵌合抗體。 PDB

2、:蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。 2、請列表總結(jié)基因工程和蛋白質(zhì)工程的相同點、不同之處(從結(jié)果、實質(zhì)、流程等方面)及其聯(lián)系。 基因工程 蛋白質(zhì)工程 相同點 操作環(huán)境——生物體外;操作對象——基因;操作水平——分子 結(jié)果 天然存在的蛋白 自然不存在的蛋白 實質(zhì) 基因重組 基因修飾或基因合成 流程 中心法則 中心法則逆推 聯(lián)系 蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上的延伸,是第二代基因工程 3、蛋白質(zhì)工程的基本目標(biāo)、基本途徑是什么? 答:基本目標(biāo):對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造,或制造一種新的蛋白質(zhì),以滿足人類生產(chǎn)和生活的需要。

3、基本途徑:基因修飾或基因合成:借助計算機輔助設(shè)計、基因定點誘變和重組DNA技術(shù) 4、目前有哪些蛋白質(zhì)工程分子改造的常用方法? 答:⒈基因定點突變技術(shù)(小改):即通過在DNA水平上進行堿基的取代、插入或缺失,達到改變基因,從而改變編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的技術(shù),包括核苷酸引物誘變,盒式誘變,PCR誘變,隨機誘變。⒉基因剪切和融合(中改):原理:將編碼某蛋白的部分基因移植到另種蛋白基因上,經(jīng)克隆、表達,產(chǎn)生新的融合蛋白??蛇_到使蛋白易于表達、純化、細胞定位等,或使蛋白性質(zhì)改變。⒊基因全合成(大改):合成DNA,然后表達出相應(yīng)蛋白。可以全部由人工控制,便于設(shè)計和改造,還適用于同時實現(xiàn)多處突變。 5、

4、蛋白質(zhì)工程中增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的基本途徑有哪些? 答:蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究表明,上述穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的因素是由蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中某一個或某一段氨基酸序列決定的,人工改變或修飾這些氨基酸殘基,有可能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,又不影響其生物學(xué)活性。 設(shè)計目標(biāo) 解決辦法 熱穩(wěn)定性 引入二硫橋 增加內(nèi)氫鍵數(shù)目 改善內(nèi)疏水堆積 增加表面鹽橋 對氧化的穩(wěn)定性 把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser 把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu 把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr 對重金屬的穩(wěn)定性 把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser 把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu

5、 替代表面羧基 pH穩(wěn)定性 替換表面荷電基團 His、Cys以及Tyr的置換 內(nèi)離子對的置換 提高酶學(xué)性質(zhì) 專一性的改變 增加逆轉(zhuǎn)數(shù)(turnover number) 改變酸堿度 6、請簡述PCR介導(dǎo)的定點突變技術(shù)原理及優(yōu)缺點。 答:4種引物3次PCR。優(yōu)點:操作簡單,突變的成功率可達100%。缺點:①后續(xù)工作較復(fù)雜,PCR擴增通常需要連接到載體分子上,然后才能對突變的基因進行轉(zhuǎn)錄,翻譯等方面的研究。②不論是用普通的TaqDNA聚合酶還是高保真的Pfu酶,PCR方法產(chǎn)生的DNA片段都要經(jīng)過核苷酸序列測定,方可確證有無其他突變發(fā)生。 7、天然胰島素制劑在儲存中易

6、形成二聚體和六聚體,延緩胰島素從注射部位進入血液,從而延緩了其降血糖作用,也增加了抗原性,其結(jié)構(gòu)如下。將胰島素B9殘基上極性的Ser置換為帶電荷Asp,同時把B27極性的Thr置換為帶負電荷的Glu,由此可制成速效胰島素。請闡述其原理。 答:已知二體形成過程中,兩個分子的結(jié)合面上SerB9與β鏈α螺旋上的Glu B13側(cè)鏈相靠近,兩個分子間的Glu B13相靠近,并且側(cè)鏈上帶有相同電荷,它們本身就有互斥作用。如果將臨近的Ser B9置換為Asp,可在二體間形成連續(xù)4個帶負電的側(cè)鏈,在六體中這種互斥的接觸重復(fù)三次,應(yīng)該有利于降低胰島素分子的締合作用。經(jīng)過這樣的改造,雙突變Ser B9 Asp/

7、Thr B27 Glu有效地使二體在毫摩爾濃度下解聚為單體,它進入血液的吸收率也比天然胰島素提高了三倍。核磁共振譜研究表明它也保持了與天然蛋白相同的只要結(jié)構(gòu)特征。 8、枯草桿菌蛋白酶BNP不含二硫鍵,用蛋白質(zhì)工程引入二硫鍵時,會有怎樣的效果? 答:蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,熱穩(wěn)定性增強,二硫鍵的形成迫使同一或不同肽鏈的不同區(qū)域的氨基酸殘基向一起靠攏聚合,由此肽鏈迅速折疊并形成穩(wěn)定的空間拓撲結(jié)構(gòu),該區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)量是高度密集的;同時疏水氨基酸殘基圍繞的二硫鍵,可形成局部疏水中心,拒絕水分子進入肽的內(nèi)部破壞氫鍵,利于形成穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)區(qū)域。 9、舉例說明蛋白質(zhì)工程在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用成果。 答

8、:1、抗體工程:①臨床用鼠源單抗,面臨免疫排斥問題,引起失效和過敏,因此興起了抗體工程。有嵌合抗體、重構(gòu)抗體、單鏈抗原結(jié)合區(qū)、單功能域抗體及全套抗體研究,其主要目的是使鼠源性抗體“人源化”。 ②嵌合抗體——用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū))基因與人免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)(C區(qū) )基因相連接,構(gòu)建成嵌合基因,導(dǎo)入宿主細胞進行表達,制成嵌合抗體。目前國內(nèi)外已制備了數(shù)十種嵌合抗體。 ③該抗體 的“人源化”使其免疫原性大為降低。在初期臨床試驗中,人源化嵌合抗體能夠解決一些問題,且半衰期可以延長許多倍。但尚不能全部解決免疫原性問題, 有的嵌合抗體仍引起免疫反應(yīng)。 ④重構(gòu)抗體——是將動

9、物抗體中的高可變區(qū),又稱補體決定區(qū)與人抗體相應(yīng)的區(qū)域交換而重新構(gòu)建抗體的補體決定區(qū),以進一步“人源化”、降低單抗的免疫原性?,F(xiàn)已構(gòu)建成功數(shù)種重構(gòu)抗體,它們的抗原結(jié)合能力得以保持。 2、改良枯草桿菌蛋白酶的性質(zhì):①218位Asn,變成Ser,用65℃的失活半衰期衡量,從59分鐘增到223分鐘,酶的穩(wěn)定性顯著增加。 ②1985年Wells證明若用其他氨基酸取代Met222,可以提高枯草桿菌蛋白酶的氧化穩(wěn)定性而又保持高催化活性。 ③枯草桿菌蛋白酶可作為洗滌劑的添加劑,但底物作用范圍過窄(針對Phe羧基所形成的肽鍵),用Lys取代位于活性中心166位的Gly,使其底物作用范圍拓寬。 3、改良胰

10、島素: 天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體,延緩胰島素從注射部位進入血液,從而延緩了其降血糖作用,也增加了抗原性,這是胰島素B23-B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基,則可降低其聚合作用,使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過臨床實驗。 4、改良生長激素:生長素有時會結(jié)合催乳激素受體,引起副作用,18位、21位氨基酸改造,可能有望降低這種副作用。 5、改良治癌酶:改良皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶有殺死癌細胞功能,有人篩選到6個AA替換后(活性部位附近),催化能力大大提高。 6、改良T4溶菌酶: 將T4溶菌酶的第3位異亮氨酸變成半胱氨酸,后者與第97位的半胱氨酸形成二硫鍵,從而穩(wěn)定了兩個結(jié)構(gòu)域所形成的活性中心,使酶在高溫下的穩(wěn)定性大大提高。如果將該酶的第51位蘇氨酸換成脯氨酸,可使酶的活性提高25倍。

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