Marfey法和質譜聯(lián)用技術【行業(yè)一類】

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1、 MarfeyMarfey法與質譜聯(lián)法與質譜聯(lián)用技術及其應用用技術及其應用 版權歸屬：百度文庫賬戶 拜水81講課材料目目 錄錄前言前言LC/MS決定氨基酸絕對構型的原理決定氨基酸絕對構型的原理 1.Marfey 法分離機制的探討法分離機制的探討 2.Marfey法與質譜的聯(lián)用法與質譜的聯(lián)用 3.衍生化過程衍生化過程小小 結結應應 用用 舉舉 例例2講課材料前前 言言常見的確定化合物立體結構的方法有如下幾常見的確定化合物立體結構的方法有如下幾種：種：（1）化學轉變法；）化學轉變法；（2）旋光比較法；）旋光比較法；（3）旋光譜（）旋光譜（ORD）和圓二色光譜（）和圓二色光譜（CD）；）；（4）單晶

2、）單晶X射線衍射法；射線衍射法；（5）核磁共振法；）核磁共振法；（6）Marfey法與質譜聯(lián)用。法與質譜聯(lián)用。3講課材料 目前酶法和目前酶法和CD法已用于決定氨基酸的絕對法已用于決定氨基酸的絕對構型，但這些都是直接的方法，構型，但這些都是直接的方法，確定一種對映確定一種對映異構體時需要相對大量的樣品及較長的分析時間，異構體時需要相對大量的樣品及較長的分析時間，因為在分析之前必須將每種氨基酸分離出來。因為在分析之前必須將每種氨基酸分離出來。另一方面，色譜方法例如另一方面，色譜方法例如GC和和HPLC已經(jīng)已經(jīng)代替這些直接方法廣泛使用，氨基酸的絕對構型代替這些直接方法廣泛使用，氨基酸的絕對構型是通過

3、衍生化后，在非對映環(huán)境下比較對照品氨是通過衍生化后，在非對映環(huán)境下比較對照品氨基酸的保留時間來決定的，這些色譜學方法的優(yōu)基酸的保留時間來決定的，這些色譜學方法的優(yōu)點在于分析所用的樣品用量少、節(jié)省時間，并且點在于分析所用的樣品用量少、節(jié)省時間，并且可以同時分析十種以上氨基酸。色譜學方法的缺可以同時分析十種以上氨基酸。色譜學方法的缺點在于需要對照品氨基酸，對于含有非常見氨基點在于需要對照品氨基酸，對于含有非常見氨基酸的肽類是不適用的。酸的肽類是不適用的。4講課材料1984年，年，Marfey發(fā)明了一種用發(fā)明了一種用HPLC來決定氨來決定氨基酸絕對構型的方法，該方法基于這樣一個原理：基酸絕對構型的方

4、法，該方法基于這樣一個原理：通過手性試劑進行衍生化，將通過手性試劑進行衍生化，將D-和和L-氨基酸用氨基酸用HPLC分離成對映異構體。分離成對映異構體。于是引入手性試劑于是引入手性試劑FDAA（1-氟氟-2，4-二硝基二硝基苯基苯基-5）-L-丙氨酰胺，丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4-dinitrophenyl-5)-L-alaninamide ），被命名為），被命名為Marfey試劑。試劑。N O2O2NFN HN H2OH3C5講課材料氨基酸與氨基酸與Marfey試劑反應所得衍生物用常用的試劑反應所得衍生物用常用的HPLC進行分離，并在進行分離，并在UV340 nm處進行檢測。處進行

5、檢測。L-氨基酸衍生物常常先于對應的氨基酸衍生物常常先于對應的D-氨基酸衍生物氨基酸衍生物從柱上洗脫下來，在梯度洗脫的條件下，該方法從柱上洗脫下來，在梯度洗脫的條件下，該方法能正確地確定氨基酸的絕對構型，并且具有很高能正確地確定氨基酸的絕對構型，并且具有很高的靈敏度。的靈敏度。因此，因此，Marfey法廣泛用于肽類化合物的結構確法廣泛用于肽類化合物的結構確證，證實肽類合成中的外消旋作用。證，證實肽類合成中的外消旋作用。但是，在沒有標準品的情況下，將該方法用來分但是，在沒有標準品的情況下，將該方法用來分析含非常見氨基酸的肽類還是很困難的。析含非常見氨基酸的肽類還是很困難的。6講課材料常見的Mar

6、fey試劑如下所示：L-FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺 L-FDVA:.-L-纈氨酰胺 L-FDPA:.-L-苯丙氨酰胺 L-FDIA:.-L-異亮氨酰胺 L-FDLA:.-L-亮氨酰胺 D-FDAA:.-D-丙氨酰胺7講課材料其結構如下：NO2O2NFNHNH2RONO22ONFNHNH2ROFDAA:R=CH3FDVA:R-CH(CH3)2FDPA:R=CH2-PhFDIA:R=CH(CH3)CH2CH3FDLA:R=CH2CH(CH3)2D-FDAA8講課材料 為了將為了將Marfey法與質譜聯(lián)用的方法建立起法與質譜聯(lián)用的方法建立起來，必須解決如下三個問題：來

7、，必須解決如下三個問題：（1）解釋）解釋Marfey法用作色譜技術的分離機制，法用作色譜技術的分離機制，及其局限。及其局限。（2）如何在沒有標準品的情況下有效地將）如何在沒有標準品的情況下有效地將Marfey法和質譜聯(lián)系起來，來檢測和確定目法和質譜聯(lián)系起來，來檢測和確定目標氨基酸。標氨基酸。（3）如何從一個肽類樣品的）如何從一個肽類樣品的L-或或D-氨基酸中獲氨基酸中獲得相應的對映異構體得相應的對映異構體9講課材料LC/MS LC/MS 決決 定定 氨氨 基基 酸酸絕絕 對對 構構 型型 的的 原原 理理Marfey 法分離機制的探討法分離機制的探討Marfey法與質譜的聯(lián)用法與質譜的聯(lián)用衍生

8、化過程衍生化過程10講課材料Marfey Marfey 法分離機制的探討法分離機制的探討下圖是用下圖是用LC/MS來決定肽中氨基酸絕對構型的全來決定肽中氨基酸絕對構型的全過程，命名作過程，命名作“高級高級Marfey法法”11講課材料如圖所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成兩部如圖所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成兩部分（分（sample 1和和sample 2)。Sample 1與與FDAA衍生化后，直接用衍生化后，直接用LC/MS分分析，通過衍生物的保留時間和質譜得以確定為何析，通過衍生物的保留時間和質譜得以確定為何種氨基酸，如果檢測到有非常見氨基酸，其平面種氨基酸，如果檢測到有非常見氨基酸

9、，其平面結構可以通過其衍生物的質譜得以闡明。結構可以通過其衍生物的質譜得以闡明。Sample 2主要用來決定非常見氨基酸的絕對構主要用來決定非常見氨基酸的絕對構型。由于天然存在的肽類往往由型。由于天然存在的肽類往往由D-型或型或L-型氨基型氨基酸組成，在色譜圖上，每個氨基酸給出一個峰，酸組成，在色譜圖上，每個氨基酸給出一個峰，其絕對構型無法在這一步?jīng)Q定。因此，為了得到其絕對構型無法在這一步?jīng)Q定。因此，為了得到其對映體，其對映體，Sample 2中的氨基酸必須在適當?shù)闹械陌被岜仨氃谶m當?shù)臈l件下進行外消旋化。但是，與條件下進行外消旋化。但是，與FDAA衍生化及衍生化及外消旋化后所得的色譜圖變得復

10、雜了，很難發(fā)現(xiàn)外消旋化后所得的色譜圖變得復雜了，很難發(fā)現(xiàn)一對差向異構體。一對差向異構體。12講課材料在該法中使用了質量色譜。每對差向異構體有在該法中使用了質量色譜。每對差向異構體有兩個峰，在以目標氨基酸衍生物分子離子碎片兩個峰，在以目標氨基酸衍生物分子離子碎片的的m/z值為檢測指標的質量色譜圖上可以選擇值為檢測指標的質量色譜圖上可以選擇到這兩個峰。到這兩個峰。然后，通過比較然后，通過比較Sample 1中原峰的保留時間中原峰的保留時間和和Sample 2中新產(chǎn)生峰的保留時間，就可以中新產(chǎn)生峰的保留時間，就可以根據(jù)根據(jù)Marfey法中的洗脫規(guī)律來判定絕對構型了。法中的洗脫規(guī)律來判定絕對構型了。1

11、3講課材料本法將可購得的氨基酸分為四類：中性本法將可購得的氨基酸分為四類：中性氨基酸、含氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、堿性和和酸性氨基酸、堿性和N-甲基氨基酸，在同樣的條件下研究其甲基氨基酸，在同樣的條件下研究其分離行為。分離行為。FDAA主要與氨基酸上未取代的氨基、主要與氨基酸上未取代的氨基、酚羥基、巰基包括酚羥基、巰基包括N-甲基反應。甲基反應。14講課材料每種氨基酸的非對映每種氨基酸的非對映異構體對都是通過其異構體對都是通過其D-異構體的保留時間異構體的保留時間(tRD)和和L-異構體的保異構體的保留時間留時間(tRL)的差值的差值(t)來判定的。當來判定的。當t值大值大于于1.0時，每

12、組非對時，每組非對映異構體對完全被分映異構體對完全被分離為兩個非對映異構離為兩個非對映異構體。體。左邊的表格顯示了四左邊的表格顯示了四種氨基酸的兩種異構種氨基酸的兩種異構體保留時間及其差異。體保留時間及其差異。15講課材料對中性氨基酸已經(jīng)獲得很好的判定，所有對中性氨基酸已經(jīng)獲得很好的判定，所有L-型非型非對映異構體都先于對映異構體都先于D-型被洗脫下來。隨著烴基側型被洗脫下來。隨著烴基側鏈增長，判定效率提高，保留時間也會更長（亞鏈增長，判定效率提高，保留時間也會更長（亞氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到兩衍生物，氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到兩衍生物，因為因為FDAA會引入到會引入到NH2上，

13、也會引入到酚上，也會引入到酚OH上。上。16講課材料酸性或含酸性或含OH氨基酸的判定相對于中性氨基氨基酸的判定相對于中性氨基酸要難一些。因為其保留時間變短。側鏈含酸要難一些。因為其保留時間變短。側鏈含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更難判定。在含和谷氨酸更難判定。在含OH的氨基酸中，的氨基酸中，絲氨酸顯示出最差的判定能力，但是高絲氨絲氨酸顯示出最差的判定能力，但是高絲氨酸的判定稍好些，氧甲基絲氨酸顯示了與丙酸的判定稍好些，氧甲基絲氨酸顯示了與丙氨酸相似的判定能力。另外，氨酸相似的判定能力。另外，-OH天冬氨酸天冬氨酸的兩個非對映異構體顯示相反

14、的洗脫規(guī)律，的兩個非對映異構體顯示相反的洗脫規(guī)律，而且它們的保留時間極短而且它們的保留時間極短17講課材料對于堿性氨基酸，賴氨酸和鳥氨酸有三種衍對于堿性氨基酸，賴氨酸和鳥氨酸有三種衍生物：單生物：單-取代、單取代、單-取代和二取代衍生物；取代和二取代衍生物；組氨酸有兩種衍生物，單組氨酸有兩種衍生物，單-取代和雙取代衍生取代和雙取代衍生物。它們的單物。它們的單-取代和雙取代可被判定，而單取代和雙取代可被判定，而單-取代衍生物無法判定，表明取代衍生物無法判定，表明-氨基的衍生氨基的衍生化對于判定是必要的。化對于判定是必要的。18講課材料但是堿性氨基酸的洗脫規(guī)律取決于所選流動但是堿性氨基酸的洗脫規(guī)律

15、取決于所選流動相的相的PH大小，可能為大小，可能為L D的常規(guī)順序，也的常規(guī)順序，也可能相反。賴氨酸和組氨酸的雙衍生物顯示可能相反。賴氨酸和組氨酸的雙衍生物顯示了正常的洗脫規(guī)律，而鳥氨酸卻顯示相反的了正常的洗脫規(guī)律，而鳥氨酸卻顯示相反的順序，盡管它們有較長的保留時間。順序，盡管它們有較長的保留時間。19講課材料購得的購得的N-甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的纈氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生物，甲基衍生物，盡管其保留時間長于各母氨基酸，但其判定能盡管其保留時間長于各母氨基酸，但其判定能力要低于母氨基酸。尤其是力要低于母氨基酸。尤

16、其是N-甲基丙氨酸無法甲基丙氨酸無法判定，判定，N-甲基天冬氨酸以相反順序被洗脫出。甲基天冬氨酸以相反順序被洗脫出。20講課材料綜上，綜上，F(xiàn)DAA的的L-氨基酸衍生物并不總是氨基酸衍生物并不總是先于對應的先于對應的D-氨基酸衍生物被洗脫下來。氨基酸衍生物被洗脫下來。因此，闡明不了分離機制，因此，闡明不了分離機制，Marfey 法法就不能用于非常見氨基酸的判定。就不能用于非常見氨基酸的判定。此外，實驗結果表明以下兩點對于洗脫此外，實驗結果表明以下兩點對于洗脫順序至關重要：順序至關重要：氨基酸的疏水性；氨基酸的疏水性；在分離過程中在分離過程中FDAA衍生物的構象。衍生物的構象。21講課材料使用使

17、用UV（二極管陣列檢測器）和（二極管陣列檢測器）和NMR方法來方法來解決該問題（因為，它們易受構象的影響）解決該問題（因為，它們易受構象的影響）。22講課材料如上圖所示，在如上圖所示，在340和和414nm處有特征性最處有特征性最大吸收，是由二硝基苯上的硝基與氨基酸及大吸收，是由二硝基苯上的硝基與氨基酸及L-丙氨酰胺的丙氨酰胺的NH2之間的氫鍵所形成的發(fā)色之間的氫鍵所形成的發(fā)色團產(chǎn)生的；而且，團產(chǎn)生的；而且，D-纈氨酸衍生物的纈氨酸衍生物的UV譜與譜與其其L-型衍生物的相符。所有被測氨基酸的衍型衍生物的相符。所有被測氨基酸的衍生物顯示非常相似的生物顯示非常相似的UV譜，脯氨酸和譜，脯氨酸和N-

18、甲基甲基氨基酸除外。尤其是給出相反洗脫順序的雙氨基酸除外。尤其是給出相反洗脫順序的雙取代衍生物及取代衍生物及D-和和L-鳥氨酸顯示了特征的鳥氨酸顯示了特征的UV譜，其吸收波長從譜，其吸收波長從340nm藍移到藍移到320nm。23講課材料這些結果表明，穩(wěn)定的構象，包括分子內(nèi)氫這些結果表明，穩(wěn)定的構象，包括分子內(nèi)氫鍵，形成了一個像蒽一樣的三環(huán)系統(tǒng)的平面鍵，形成了一個像蒽一樣的三環(huán)系統(tǒng)的平面分子（如下圖所示）。分子（如下圖所示）。24講課材料綜上，對于綜上，對于L-和和D-氨基酸衍生物的判定基于其氨基酸衍生物的判定基于其疏水性的差異，源于氨基酸和疏水性的差異，源于氨基酸和L-丙氨酰胺丙氨酰胺碳上兩

19、個疏水性取代基的順反位置。于是，碳上兩個疏水性取代基的順反位置。于是，順式排列的順式排列的FDAA衍生物與衍生物與ODS作用更強烈，作用更強烈，比反式排列的衍生物有更長的保留時間。比反式排列的衍生物有更長的保留時間。對于大多數(shù)氨基酸來說，由于氨基酸側鏈取代對于大多數(shù)氨基酸來說，由于氨基酸側鏈取代基的疏水性往往小于基的疏水性往往小于COOH，D-氨基酸衍生氨基酸衍生物具有順式結構，因此在物具有順式結構，因此在Marfey 法中法中L-氨基氨基酸衍生物往往先于酸衍生物往往先于D-氨基酸衍生物出柱。氨基酸衍生物出柱。另有文獻證明，氫鍵的形成對結構的判定也是另有文獻證明，氫鍵的形成對結構的判定也是很有

20、用的。很有用的。25講課材料L-纈氨酸的纈氨酸的FDAA衍生物的衍生物的NOE實驗顯示，纈實驗顯示，纈氨酸的氨酸的-質子及質子及L-丙氨酰胺的丙氨酰胺的-質子與苯環(huán)的質子與苯環(huán)的H6之間存在著強烈的之間存在著強烈的NOE，如上圖所示；，如上圖所示；而而H6與纈氨酸的異丙基和與纈氨酸的異丙基和L-丙氨酰胺的甲丙氨酰胺的甲基之間沒有基之間沒有NOE。另外，。另外，D-纈氨酸的纈氨酸的FDAA衍衍生物與生物與L-衍生物幾乎顯示相同的衍生物幾乎顯示相同的NMR行為。行為。這些結果表明，兩這些結果表明，兩-質子都在空間上位于苯環(huán)質子都在空間上位于苯環(huán)H6的附近，在的附近，在L-和和D-纈氨酸衍生物中均如

21、纈氨酸衍生物中均如此。此。由此，纈氨酸和丙氨酰胺的除由此，纈氨酸和丙氨酰胺的除NH2以外的其以外的其它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，在溶液中是穩(wěn)定的，也是占優(yōu)勢的。在溶液中是穩(wěn)定的，也是占優(yōu)勢的。26講課材料如圖所示：如圖所示：D-纈氨酸的纈氨酸的FDAA衍生物為順（衍生物為順（Z）式排列，兩個疏水性取代基在同側；式排列，兩個疏水性取代基在同側；L-纈氨纈氨酸的酸的FDAA衍生物為反（衍生物為反（E）式排列，兩個）式排列，兩個疏水性基團在異側。疏水性基團在異側。27講課材料為了確定為了確定COOH是否對結構的判定必不可是否對結構的判定必不可少

22、，文章對氨基酸甲酯和脫少，文章對氨基酸甲酯和脫COOH的氨基化的氨基化合物的合物的FDAA衍生物進行了研究。衍生物進行了研究。28講課材料所測氨基酸甲酯及氨基化合物的判定結果如上所測氨基酸甲酯及氨基化合物的判定結果如上表所示，它們的表所示，它們的UV譜與母氨基酸的完全相同，譜與母氨基酸的完全相同，保留時間比母氨基酸長，氨基酸甲酯的判定能保留時間比母氨基酸長，氨基酸甲酯的判定能力下降。力下降。另外，丙氨酸甲酯的另外，丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定，衍生物未得判定，絲氨酸甲酯衍生物顯示相反的洗脫順序。絲氨酸甲酯衍生物顯示相反的洗脫順序。氨基化合物的保留時間和判定能力幾乎與其母氨基化合物的保留時

23、間和判定能力幾乎與其母氨基酸相同。氨基酸相同。29講課材料結果表明，結果表明，COOH對于氨基酸的判定并不對于氨基酸的判定并不總是必須的。前已述，與中性氨基酸相比，總是必須的。前已述，與中性氨基酸相比，酸性和含酸性和含OH氨基酸及氨基酸甲酯的判定能氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力差，尤其是力差，尤其是-OH天冬氨酸、絲氨酸甲酯天冬氨酸、絲氨酸甲酯,給給出了相反的洗脫順序（出了相反的洗脫順序（D L）。這些數(shù)據(jù)進）。這些數(shù)據(jù)進一步證實一個氨基酸的一步證實一個氨基酸的FDAA衍生物在氨基酸衍生物在氨基酸和和L-丙氨酰胺部分有兩個處于反式的疏水性取丙氨酰胺部分有兩個處于反式的疏水性取代基，要比其相應的順

24、式氨基酸衍生物先流代基，要比其相應的順式氨基酸衍生物先流出反相柱。出反相柱。30講課材料以上結果也可如下證實，考察用以上結果也可如下證實，考察用FDPA、FDVA、FDIA、FDLA和和D-FDAA的氨基酸衍的氨基酸衍生物的分離行為，如下表所示：生物的分離行為，如下表所示：31講課材料如所預期，隨著烴基側鏈增長，其保留時間如所預期，隨著烴基側鏈增長，其保留時間也增長，判定能力也增強；而也增長，判定能力也增強；而D-FDAA的氨基的氨基酸衍生物則顯示了相反的洗脫順序。酸衍生物則顯示了相反的洗脫順序。32講課材料本機理有一缺陷，即明確地評價兩個功能基本機理有一缺陷，即明確地評價兩個功能基團的疏水性

25、是有困難的，可以考慮用氨基酸團的疏水性是有困難的，可以考慮用氨基酸衍生物保留時間的順序來解釋洗脫順序。因衍生物保留時間的順序來解釋洗脫順序。因為在氨基酸中為在氨基酸中COOH是一個常見的功能基是一個常見的功能基團，而一個氨基酸的團，而一個氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也衍生物的疏水性也決定于該氨基酸的側鏈，因此，決定于該氨基酸的側鏈，因此，DL-氨基酸的氨基酸的tR和洗脫順序間的關系已如和洗脫順序間的關系已如Table1所示。所示。如如Figure4所示，具有常規(guī)洗脫順序（所示，具有常規(guī)洗脫順序（L D）的的D-和和L-氨基酸衍生物的氨基酸衍生物的tR要比側鏈疏水性與要比側鏈疏水性與COOH相

26、當?shù)陌被嵫苌锏拈L，例如絲相當?shù)陌被嵫苌锏拈L，例如絲氨酸和天冬氨酸。氨酸和天冬氨酸。33講課材料另一方面，具有相反洗脫順序的氨基酸衍生另一方面，具有相反洗脫順序的氨基酸衍生物具有相對較短的平均保留時間。物具有相對較短的平均保留時間。34講課材料于是，目標氨基酸的洗脫順序可以用于是，目標氨基酸的洗脫順序可以用L-和和D-氨基酸衍生物的平均保留時間進行解釋。氨基酸衍生物的平均保留時間進行解釋。DL-絲氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作臨界樣品，絲氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作臨界樣品，它們的平均保留時間位于洗脫順序的臨界點它們的平均保留時間位于洗脫順序的臨界點上。上。然而，鳥氨酸的二取代衍生物表現(xiàn)出

27、非常有然而，鳥氨酸的二取代衍生物表現(xiàn)出非常有趣的分離行為，它們的洗脫順序是相反的，趣的分離行為，它們的洗脫順序是相反的，盡管它們有相對較長的保留時間（盡管它們有相對較長的保留時間（27.3min），），如如Figure4所示。對這種分離行為的研究正在所示。對這種分離行為的研究正在進行之中。進行之中。35講課材料至此，第一個問題已基本得到解決。至此，第一個問題已基本得到解決。由于氨基酸與由于氨基酸與L-FDAA所得衍生物的熱不穩(wěn)定所得衍生物的熱不穩(wěn)定性和低疏水性，致使它們對性和低疏水性，致使它們對LC/MS分析的敏分析的敏感性很差。于是，選擇電噴霧離子化和感性很差。于是，選擇電噴霧離子化和fri

28、t-FAB作為接口，并發(fā)展用作為接口，并發(fā)展用(1-氟氟-2，4-二硝基二硝基苯基苯基-5)-L-亮氨酰胺，即亮氨酰胺，即L-FDLA取代取代FDAA:(1-氟氟-2，4-二硝基苯基二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作為丙氨酰胺，作為衍生化試劑，以便將衍生化試劑，以便將Marfey法和質譜聯(lián)系起法和質譜聯(lián)系起來。來。36講課材料MarfeyMarfey法與質譜的聯(lián)用法與質譜的聯(lián)用在在Marfey法中，氨基酸的法中，氨基酸的L-FDAA衍生物由常衍生物由常規(guī)的反相規(guī)的反相HPLC分離并在分離并在UV340nm處檢測；在處檢測；在本法中，本法中，UV檢測器被換成質譜儀，即氨基酸衍檢測器被換成質譜儀，

29、即氨基酸衍生物經(jīng)生物經(jīng)LC/MS分析。分析。為了順利地將傳統(tǒng)的為了順利地將傳統(tǒng)的HPLC條件改為適合條件改為適合LC/MS分析的分析的LC條件，必須解決如下兩個問題：條件，必須解決如下兩個問題：37講課材料（1）將從將從HPLC洗脫出來的液體注入質譜儀時，洗脫出來的液體注入質譜儀時，其體積應大大減小，因為其體積應大大減小，因為ESI和和frit-FAB是最終是最終被作為一種接口來使用的。被作為一種接口來使用的。（2）HPLC流動相中的非揮發(fā)性緩沖液應用揮發(fā)流動相中的非揮發(fā)性緩沖液應用揮發(fā)性緩沖液代替。性緩沖液代替。解決方法：解決方法：（1）應用半微量柱（）應用半微量柱（1502.1mm I.d

30、,），本法），本法用該柱給予用該柱給予L-和和D-氨基酸衍生物以足夠的分離氨基酸衍生物以足夠的分離度。若為度。若為frit-FAB LC/MS 溶液流速應進一步減溶液流速應進一步減小至小至5l/min。（2）使用使用TFA或醋酸銨緩沖液（或醋酸銨緩沖液（PH3）作為流）作為流動相，與使用磷酸緩沖溶劑系統(tǒng)有幾乎相同的動相，與使用磷酸緩沖溶劑系統(tǒng)有幾乎相同的分離度。分離度。38講課材料嘗試了嘗試了4種用于分析氨基酸種用于分析氨基酸L-FDAA衍生物的衍生物的LC/MS接口，即接口，即ESI、大氣壓化學離子化、大氣壓化學離子化（APCI）、）、TSP、和、和frit-FAB。極性氨基酸衍。極性氨基酸

31、衍生物不能用生物不能用TSP和和APCI作為接口。作為接口。盡管任何氨基酸都可以用盡管任何氨基酸都可以用ESI和和frit-FAB接口，接口，但它們的靈敏度特別低，這可能是由于氨基酸但它們的靈敏度特別低，這可能是由于氨基酸的的L-FDAA衍生物的熱不穩(wěn)定性和低疏水性造衍生物的熱不穩(wěn)定性和低疏水性造成的，表明需要制備一種高疏水性的衍生化試成的，表明需要制備一種高疏水性的衍生化試劑。此外，劑。此外，ESI和和frit-FAB被選作接口，還因被選作接口，還因為使用這種接口可以抑制溫度誘導效應。為使用這種接口可以抑制溫度誘導效應。在在FAB-MS中，疏水性越強的化合物其分離效中，疏水性越強的化合物其分

32、離效果越好。果越好。39講課材料衍生化過程衍生化過程引入了一個外消旋化程序，使用引入了一個外消旋化程序，使用DL-FDLA代替代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學外消旋化，以得到傳統(tǒng)的化學外消旋化，以得到L-或或D-氨基酸相氨基酸相應的對映異構體。應的對映異構體。為了獲得滿足以下條件的衍生化試劑：為了獲得滿足以下條件的衍生化試劑：（1）可獲得更高疏水性的氨基酸衍生物；）可獲得更高疏水性的氨基酸衍生物；（2）不減少以前）不減少以前L-FDAA衍生物的特征衍生物的特征UV吸收；吸收；（3）符合通常所言的分離機制。）符合通常所言的分離機制。40講課材料嘗試了嘗試了4種衍生化試劑種衍生化試劑L-FDVA、L-FDPA、L-

33、FDIA和和L-FDLA，具體數(shù)據(jù)如，具體數(shù)據(jù)如Table1所示：所示：（1）被測衍生化試劑的保留時間要比）被測衍生化試劑的保留時間要比L-FDAA長；長；（2）L-FDLA M+H+的離子豐度最高，約為的離子豐度最高，約為L-FDAA的的30倍。倍。41講課材料由由 Table2可知，可知，L-FDLA的分離效果的分離效果要強于要強于L-FDAA由由Table1、Table2得，得，L-FDLA是用是用于于LC/MS分析的最分析的最有效的衍生化試劑。有效的衍生化試劑。42講課材料為了確證為了確證L-FDLA的實用性，的實用性，L-FDLA的氨基的氨基酸衍生物使用以酸衍生物使用以frit-FA

34、B 或或ESI作為接口的作為接口的LC/MS進行分析。為了比較氨基酸的進行分析。為了比較氨基酸的L-FDAA衍生物和衍生物和L-FDLA衍生物在相同條件下的電離衍生物在相同條件下的電離情況，兩種衍生物的等量混合物進行情況，兩種衍生物的等量混合物進行LC/MS分分析。如析。如Ffigure1所示所示43講課材料DL-丙氨酸的丙氨酸的L-FDAA和和L-FDLA衍生物的衍生物的M+H+陽離子質量色譜，其整體質譜使用陽離子質量色譜，其整體質譜使用frit-FAB 作為接口。作為接口。L-FDLA衍生物的靈敏度衍生物的靈敏度比比L-FDAA衍生物的提高了三倍，這種趨勢適衍生物的提高了三倍，這種趨勢適合

35、于任何常見氨基酸。合于任何常見氨基酸。對于對于ESI LC/MS，不管采用陽離子還是陰離，不管采用陽離子還是陰離子模式，靈敏度都提高子模式，靈敏度都提高24倍。倍。由上可知，由上可知，L-FDLA不僅適用于不僅適用于HPLC分析，分析，也適用于也適用于LC/MS分析。分析。使用使用frit-FAB 和和ESI LC/MS的檢測限分別為的檢測限分別為10和和5pmol。44講課材料通常，天然存在的氨基酸都是由通常，天然存在的氨基酸都是由D-或或L-構構型的氨基酸組成的，每種氨基酸只能在色型的氨基酸組成的，每種氨基酸只能在色譜圖上顯示一個峰譜圖上顯示一個峰,絕對構型不能通過其絕對構型不能通過其他方

36、法來解決。因此，為了從他方法來解決。因此，為了從D/L氨基酸氨基酸獲得一對對映體，進行外消旋化是很有必獲得一對對映體，進行外消旋化是很有必要的。要的。最初使用的外消旋化方法為：最初使用的外消旋化方法為：水解產(chǎn)物水解產(chǎn)物+醋酐醋酐+三乙胺三乙胺 唑酮中間體唑酮中間體 外消旋化的外消旋化的N-乙酰基氨基酸乙?；被?水解水解 目標產(chǎn)目標產(chǎn)物物45講課材料優(yōu)點：對于肽中少數(shù)氨基酸來說是簡單可行的。優(yōu)點：對于肽中少數(shù)氨基酸來說是簡單可行的。缺點：缺點：耗時；耗時；難于終止外消旋化作用；難于終止外消旋化作用；當氨基酸中含兩個不對稱碳原子（如蘇氨酸、當氨基酸中含兩個不對稱碳原子（如蘇氨酸、亮氨酸）時，就

37、不能給出對映異構體的混合物，亮氨酸）時，就不能給出對映異構體的混合物，而是非對映體的混合物。而是非對映體的混合物。46講課材料如上圖所示，如上圖所示，D-氨基酸的氨基酸的L-FDLA衍生物（衍生物（DL型）和型）和L-氨基酸的氨基酸的L-FDLA（LL型）衍型）衍生物是非對映異構體，在色譜圖上給出不同生物是非對映異構體，在色譜圖上給出不同的保留時間；的保留時間；另一方面，另一方面，LD和和DL型、型、DD和和LL型型是對映異構體，每一對都顯示相同的保留時是對映異構體，每一對都顯示相同的保留時間，即某氨基酸的間，即某氨基酸的D-FDLA衍生物與該氨基酸衍生物與該氨基酸的對映異構體的的對映異構體的

38、L-FDLA衍生物有相同的保留衍生物有相同的保留時間。時間。據(jù)此，有望以據(jù)此，有望以D-和和L-FDLA的等量混合物代替的等量混合物代替只以只以L-FDLA做衍生化試劑，來得到前述的外做衍生化試劑，來得到前述的外消旋化作用。消旋化作用。47講課材料上圖還表明，用上圖還表明，用D/L-FDLA進行衍生化是可行進行衍生化是可行的，該方法用于含兩個不對稱碳原子的氨基的，該方法用于含兩個不對稱碳原子的氨基酸時，所得兩個峰對應于原氨基酸和其對映酸時，所得兩個峰對應于原氨基酸和其對映異構體的異構體的L-FDLA衍生物。衍生物。此外，化學外消旋化和此外，化學外消旋化和D/L-FDLA衍生化相結衍生化相結合用

39、于含兩個不對稱碳原子的氨基酸時，可合用于含兩個不對稱碳原子的氨基酸時，可能在能在HPLC譜中產(chǎn)生四個異構體峰。譜中產(chǎn)生四個異構體峰。48講課材料小小 結結 至此，LC/MS聯(lián)用的三個問題已得到解決：問題一：采用什么色譜技術來分離氨基酸。我們采用Marfey法作為色譜技術。問題二：怎樣有效地將Marfey法與質譜聯(lián)系起來。我們采用ESI和Frit-FAB作為接口。問題三：怎樣能得到D-或L-氨基酸的對映體。使用了用來衍生化的L-FDLA和用來外消旋化的D/L-FDLA代替FDAA。49講課材料這樣就建立了一個運用這樣就建立了一個運用LC/MS，稱作，稱作“advanced Marfeys met

40、hod”的非經(jīng)驗性的非經(jīng)驗性方法，該法有三部分組成：方法，該法有三部分組成：用于分離氨基酸的色譜技術：用于分離氨基酸的色譜技術：Marfey法；法；通過質譜方法檢驗氨基酸；通過質譜方法檢驗氨基酸；從從L-或或D-氨基酸得到相應的對映異構體的過氨基酸得到相應的對映異構體的過程。程。本法的突出優(yōu)點是：本法的突出優(yōu)點是：可以在沒有標準品的情況下確定絕對構型；可以在沒有標準品的情況下確定絕對構型；可以同時分析肽鏈中的任何氨基酸?？梢酝瑫r分析肽鏈中的任何氨基酸。50講課材料應應 用用 舉舉 例例該法已經(jīng)成功運用于肽鏈中氨基酸的結構確定。該法已經(jīng)成功運用于肽鏈中氨基酸的結構確定。還用于研究伯胺類化合物、仲

41、醇類化合物和含噻還用于研究伯胺類化合物、仲醇類化合物和含噻唑環(huán)的氨基酸等的絕對構型。唑環(huán)的氨基酸等的絕對構型。下面簡要介紹一下運用該法對藻青菌下面簡要介紹一下運用該法對藻青菌（cyanobacteria）所產(chǎn)生的）所產(chǎn)生的microcystin LR中中的氨基酸的結構研究。的氨基酸的結構研究。51講課材料Microcystin LR是一種毒性環(huán)肽，由七個氨基是一種毒性環(huán)肽，由七個氨基酸片段組成，其中酸片段組成，其中-甲基天冬氨酸（甲基天冬氨酸（-MeAsp）分子中有兩個不對稱中心。如下圖分子中有兩個不對稱中心。如下圖52講課材料Microcystin LR的水解產(chǎn)物被分成兩部分，一的水解產(chǎn)物被

42、分成兩部分，一部分與部分與L-FDLA進行衍生化，另一部分與進行衍生化，另一部分與D/L-FDLA進行衍生化，衍生物先經(jīng)過進行衍生化，衍生物先經(jīng)過HPLC的二的二極管陣列檢測器檢測其極管陣列檢測器檢測其UV譜，然后以陰離子譜，然后以陰離子模式進行模式進行ESI LC/MS分析。分析。53講課材料如如Figure5a所示為谷氨酸、所示為谷氨酸、-甲基天冬氨酸甲基天冬氨酸（-MeAsp）、丙氨酸和亮氨酸的）、丙氨酸和亮氨酸的L-FDLA衍衍生物以生物以M-H值監(jiān)測的質量色譜圖，其中精值監(jiān)測的質量色譜圖，其中精氨酸的氨酸的L-FDLA衍生物是以衍生物是以M+TFA-H值進值進行檢測的。五個氨基酸的與

43、其行檢測的。五個氨基酸的與其m/z值對應的峰值對應的峰在質量色譜圖上都有明確地顯示。在質量色譜圖上都有明確地顯示。該方法的另一個有點是能夠發(fā)現(xiàn)任何非正常氨該方法的另一個有點是能夠發(fā)現(xiàn)任何非正常氨基酸的反應產(chǎn)物，在這里基酸的反應產(chǎn)物，在這里3（S）-Adda-L-FDLA峰就是這種情況。峰就是這種情況。54講課材料在水解產(chǎn)物的在水解產(chǎn)物的D/L-FDLA衍生物的質量色譜上，衍生物的質量色譜上，有新產(chǎn)生的對映體峰（有新產(chǎn)生的對映體峰（Figure5b），根據(jù)其），根據(jù)其洗脫順序得出結論：在洗脫順序得出結論：在Microcystin LR中，中，精氨酸精氨酸(arginine)、和亮氨酸、和亮氨酸(

44、leucine)具有具有L-構型，而谷氨酸構型，而谷氨酸(glutamic acid)、丙氨酸、丙氨酸(alanine)、和、和-甲基天冬氨酸甲基天冬氨酸(-MeAsp)具具有有D-構型。構型。由于由于Microcystin LR中的中的-MeAsp的相對構的相對構型已被闡明為赤式，故它應為型已被闡明為赤式，故它應為D-赤式構型赤式構型另外，比較另外，比較m/z值為值為706的衍生物峰發(fā)現(xiàn)，在的衍生物峰發(fā)現(xiàn)，在質量色譜圖上，質量色譜圖上，L-FDLA衍生物要先于衍生物要先于D-衍生衍生物被洗脫下來，推測物被洗脫下來，推測Adda中的不對稱碳原子中的不對稱碳原子C-3具有具有S構型。構型。55講課材料版權歸制作人所有FDAA Marfey 試劑現(xiàn)貨供應，純度98%CAS號:95713-52-3 產(chǎn)品規(guī)格：50mg 500mg 1g 5g 100g 1000g 聯(lián)系人：海經(jīng)理 聯(lián)系電話：15801753124咨詢QQ：1344226431 郵箱：上海瞻泰新材料有限公司產(chǎn)品附帶NMR、HPLC檢測信息，價格實惠56講課材料