《免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)【優(yōu)質(zhì)內(nèi)容】》由會(huì)員分享,可在線閱讀,更多相關(guān)《免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)【優(yōu)質(zhì)內(nèi)容】(37頁珍藏版)》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、 免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1高級培訓(xùn)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新技術(shù),也稱超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞化學(xué)。目的:目的:將化學(xué)研究與形態(tài)觀察相統(tǒng)一,要求在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究細(xì)胞內(nèi)各種生化物質(zhì)(蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等)的定位情況以及這些生化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化,用以闡明細(xì)胞、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。2高級培訓(xùn) 免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物,根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理,用高電產(chǎn)物,根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合
2、原理,用高電子密度的標(biāo)記物(如:金、鐵蛋白等)在超微結(jié)構(gòu)水子密度的標(biāo)記物(如:金、鐵蛋白等)在超微結(jié)構(gòu)水平上檢測某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一平上檢測某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一種方法。種方法。3高級培訓(xùn) 目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù),免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù),免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù),此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白體金技術(shù),此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白-抗抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。用以標(biāo)記抗體的酶要具備以下條件:用以標(biāo)記抗體的酶要具備以下條件:1.與抗體(或抗原)結(jié)
3、合后,仍能保持酶和抗體(或抗原)的生物活性。與抗體(或抗原)結(jié)合后,仍能保持酶和抗體(或抗原)的生物活性。2.酶的純度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價(jià)。酶的純度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價(jià)。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標(biāo)技術(shù)中最常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶(酶標(biāo)技術(shù)中最常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶(HRP)4高級培訓(xùn)電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則 1 1、取材與固定、取材與固定 取材原則與常規(guī)電鏡取材相同,力求保持組織新鮮,標(biāo)本固定要求取材原則與常規(guī)電鏡取材相同,力求保持組織新鮮,標(biāo)本固定要求是
4、既要保持組織成分的抗原性,又要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的是既要保持組織成分的抗原性,又要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時(shí)固定隊(duì)抗原性保存好,但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。甲醛短時(shí)固定隊(duì)抗原性保存好,但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。(1 1)2%2%多聚甲醛液多聚甲醛液 (2 2)2%2%多聚甲醛多聚甲醛-0.01%-0.01%0.05%0.05%戊二醛戊二醛 (3 3)4%4%多聚甲醛多聚甲醛-0.5%-0.5%苦味酸苦味酸-0.5%-0.5%戊二醛戊二醛 5高級培訓(xùn)o 2通過冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。通過冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。冰凍切片冰凍切片 8m,震動(dòng)切片,震動(dòng)切片2080m。o
5、3漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進(jìn)行標(biāo)記染色。漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進(jìn)行標(biāo)記染色。o 4DAB顯色后再進(jìn)行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。顯色后再進(jìn)行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。o 5.如果確定待測抗原的抗原性不會(huì)由于脫水包埋引起失活如果確定待測抗原的抗原性不會(huì)由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色。的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色。6高級培訓(xùn)三、免疫染色三、免疫染色o包埋前染色:是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免疫染色,然后包埋前染色:是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免疫染色,然后再進(jìn)行脫水包埋超薄切片。再進(jìn)行脫水包埋超薄切片。優(yōu)點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):(1 1)切片染色前未經(jīng)四
6、氧化鋨固定、脫水、包埋等處理,切片染色前未經(jīng)四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理,對抗原性破壞較小。(對抗原性破壞較小。(2 2)可在定位后再進(jìn)行超薄切片,提高陽性檢)可在定位后再進(jìn)行超薄切片,提高陽性檢出率出率.(3 3)免疫染色后,用四氧化鋨后固定,有利于膜型結(jié)構(gòu)的保)免疫染色后,用四氧化鋨后固定,有利于膜型結(jié)構(gòu)的保存。存。o包埋后染色:是指在超薄切片上進(jìn)行免疫染色。包埋后染色:是指在超薄切片上進(jìn)行免疫染色。o優(yōu)點(diǎn):抗原暴露在超薄切片上,不存在免疫試劑分子穿透障礙,不優(yōu)點(diǎn):抗原暴露在超薄切片上,不存在免疫試劑分子穿透障礙,不需要穿透劑。需要穿透劑。7高級培訓(xùn)2.免疫染色免疫染色 直接法:用酶標(biāo)抗
7、體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合,直接法:用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合,爾后進(jìn)行酶與底物反應(yīng),終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。爾后進(jìn)行酶與底物反應(yīng),終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。間接法:依次使用兩種不同抗體,先使用未標(biāo)記的特異性間接法:依次使用兩種不同抗體,先使用未標(biāo)記的特異性抗體即第一抗體,后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過抗體即第一抗體,后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過氧化物酶標(biāo)記第二抗體,最后酶與底物反應(yīng),生產(chǎn)沉淀。氧化物酶標(biāo)記第二抗體,最后酶與底物反應(yīng),生產(chǎn)沉淀。8高級培訓(xùn)o 結(jié)果判定結(jié)果判定o 在已知陽性、陰性樣品成立的前提下,出現(xiàn)高在已知陽性、陰性樣品成立的前提下,出現(xiàn)
8、高電子密度的顆粒,即指示抗原抗體的存在。電子密度的顆粒,即指示抗原抗體的存在。9高級培訓(xùn)(二)膠體金免疫電鏡技術(shù)(二)膠體金免疫電鏡技術(shù) 利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì),使其利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì),使其與抗體相互吸引從而將抗體標(biāo)記。再以金標(biāo)記的抗體與抗體相互吸引從而將抗體標(biāo)記。再以金標(biāo)記的抗體與待檢抗原相互結(jié)合,由于金顆粒的電子密度高,電與待檢抗原相互結(jié)合,由于金顆粒的電子密度高,電鏡觀察到金顆粒的位置,即抗原所在。鏡觀察到金顆粒的位置,即抗原所在。10高級培訓(xùn)2、膠體金的特性 顏色:膠體金的顏色與金粒子的直徑有關(guān),5-60nm時(shí)為紅色,95nm是為藍(lán)色,用于免疫細(xì)胞化學(xué)的
9、膠體金呈紅葡萄酒色。影響膠體金穩(wěn)定的因素:a.電解質(zhì):少量有促進(jìn)穩(wěn)定的作用,過量則破壞。b.膠體金的濃度:濃度越高容易導(dǎo)致膠體金凝集。c.溫度:長時(shí)間加熱可使穩(wěn)定性有所下降。11高級培訓(xùn) 檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關(guān)系0.01%氯化金 1%檸檬酸三鈉 膠體金顆粒直徑 (ml)(ml)(nm)100 3.0 19.0100 4.0 15.0100 6.0 12.5100 1.5 24.5100 1.0 41.0100 0.6 71.5(1)膠體金的制備)膠體金的制備 檸檬酸三鈉還原法(檸檬酸三鈉還原法(15nm)鞣酸鞣酸-檸檬酸鈉還原法(檸檬酸鈉還原法(6nm)12高級培訓(xùn) 鞣酸-檸檬酸鈉還原
10、法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 去離子雙蒸水 膠體金顆粒直徑 (ml)(ml)(ml)(ml)(nm)4 0.02 0 19.98 15 4 0.1 0 19.90 10 4 0.5 0.5 15.00 6.0 4 3 3 14.00 3.513高級培訓(xùn)優(yōu)點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白,而且蛋白的膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白,而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯的變化。生物活性不發(fā)生明顯的變化。金顆粒具有很高的電子密度,在電鏡下金顆粒金顆粒具有很高的電子密度,在電鏡下金顆粒清晰可辨,易精確定位。清晰可辨,易精確定位。14高級培訓(xùn)不僅可
11、以用于透射電鏡的超薄切片觀察,也可以用于不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察,也可以用于掃描電鏡對細(xì)胞表面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。掃描電鏡對細(xì)胞表面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。膠體金標(biāo)記物易于制備,而且可以根據(jù)需要制備不同膠體金標(biāo)記物易于制備,而且可以根據(jù)需要制備不同大小的膠體金,因此可以進(jìn)行免疫電鏡的雙重標(biāo)記。大小的膠體金,因此可以進(jìn)行免疫電鏡的雙重標(biāo)記。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少,可進(jìn)根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少,可進(jìn)行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。15高級培訓(xùn)o(2)電鏡包埋前免疫金染色)電鏡包埋前免疫金染色o 新鮮組織經(jīng)適當(dāng)固
12、定(新鮮組織經(jīng)適當(dāng)固定(0.5%戊二醛戊二醛-2%多聚甲多聚甲醛固定醛固定0.51h),制成厚切片。),制成厚切片。o 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗漂洗3次,每次次,每次15min。o 0.1mol/L甘氨酸漂洗甘氨酸漂洗10min,滅活自由醛基。,滅活自由醛基。o TBS漂洗,漂洗,5min3次,次,o 1%牛血清孵育組織塊牛血清孵育組織塊30min。16高級培訓(xùn)o 第一抗體第一抗體4孵育過夜后室溫繼續(xù)放置孵育過夜后室溫繼續(xù)放置2h。o TBS漂洗,漂洗,5min3次,次,o 室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針(二抗膠體金探室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針(二抗膠體金探針或蛋白針
13、或蛋白A膠體金探針等)孵育膠體金探針等)孵育60min。o TBS漂洗,漂洗,3min3次,后再用雙蒸水漂洗切片。次,后再用雙蒸水漂洗切片。o 2%戊二醛戊二醛-2多聚甲醛固定多聚甲醛固定1h,1%鋨酸固定鋨酸固定3060min,常規(guī)脫水,包埋,切片染色后電鏡觀察。,常規(guī)脫水,包埋,切片染色后電鏡觀察。17高級培訓(xùn)(3)電鏡包埋后免疫金染色法 o 超薄切片5070nm,置于鎳網(wǎng)或金網(wǎng)中。o 1%H2O2蝕刻,使試劑能穿透標(biāo)本。EPON包埋的組織蝕刻時(shí)間約10min,而LRWhite、LR Gold包埋的組織蝕刻時(shí)間則常小于5min.18高級培訓(xùn)o 雙蒸水漂洗雙蒸水漂洗3次,每次次,每次10mi
14、n。o 1%牛血清孵育切片牛血清孵育切片15min。o 載網(wǎng)不沖洗,摔干后直接移至第一抗滴上,在室溫孵育載網(wǎng)不沖洗,摔干后直接移至第一抗滴上,在室溫孵育12h或或41824h。o TBS漂洗,漂洗,3min3次。次。o 室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針(二抗膠體金探針或蛋白室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針(二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探膠體金探針等)孵育針等)孵育3060min。o TBS漂洗,漂洗,3min3次,后在用雙蒸水漂洗切片。次,后在用雙蒸水漂洗切片。o 醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。19高級培訓(xùn)2.電鏡免疫金染色 用于電鏡的免疫金法可以采用包埋
15、前染色和包埋后染色,可根據(jù)抗原的性質(zhì)加以選擇。染色方法也有直接法和間接法。20高級培訓(xùn)o(5)染色結(jié)果判斷染色結(jié)果判斷o 假陽性染色和假陰性染色假陽性染色和假陰性染色o 可以通過調(diào)整固定液種類、濃度、固定時(shí)間,改變可以通過調(diào)整固定液種類、濃度、固定時(shí)間,改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時(shí)間、溫度等減一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時(shí)間、溫度等減少假陽性和假陰性染色。少假陽性和假陰性染色。21高級培訓(xùn)雙標(biāo)記菌毛上兩種抗原,膠體金5nm,20nm22高級培訓(xùn)圖7-11 血小板表面膠體金標(biāo)記GPIb單抗 900023高級培訓(xùn)鐵蛋白標(biāo)記電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 鐵蛋白標(biāo)記抗體是由Singer(1959)首
16、創(chuàng)的一種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。這技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于病毒和細(xì)胞表面抗原的檢測。鐵蛋白作為電鏡觀察的標(biāo)記物,具有顆粒大、分辨率高、散射力強(qiáng)的特點(diǎn),可用于細(xì)胞膜表面抗原的準(zhǔn)確定位。所以,雖然40年后的今天已發(fā)展了多種免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù),但鐵蛋白標(biāo)記法仍然是一種基本技術(shù)。24高級培訓(xùn)基本原理:基本原理:鐵蛋白是一種直徑鐵蛋白是一種直徑101012nm12nm的球形的蛋白質(zhì)(分的球形的蛋白質(zhì)(分子量子量450kD450kD),它含有致密的鐵膠粒核心(直徑約它含有致密的鐵膠粒核心(直徑約7.5nm7.5nm),該核心含),該核心含2000200050005000個(gè)鐵原子,分布于四個(gè)鐵原子,分布于四個(gè)區(qū)域,形成
17、四個(gè)圓形致密區(qū),具有很高的電子密度,個(gè)區(qū)域,形成四個(gè)圓形致密區(qū),具有很高的電子密度,因此可用于電鏡觀察。抗體與鐵蛋白通過低分子量的因此可用于電鏡觀察??贵w與鐵蛋白通過低分子量的偶聯(lián)劑形成抗體偶聯(lián)劑形成抗體-鐵蛋白復(fù)合物,此復(fù)合物既保留抗體鐵蛋白復(fù)合物,此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性,同時(shí)因?yàn)殍F蛋白含有高電子密度的鐵膠的免疫活性,同時(shí)因?yàn)殍F蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心,便于電鏡觀察。粒核心,便于電鏡觀察。25高級培訓(xùn) 病毒免疫電鏡技術(shù)病毒免疫電鏡技術(shù)26高級培訓(xùn)27高級培訓(xùn) 28高級培訓(xùn)1、標(biāo)本染液混合染色法:29高級培訓(xùn) 2、瓊脂擴(kuò)散技術(shù):檢測的材料中病毒含量不足時(shí),為了達(dá)到濃縮病毒的目的,并去除材料中所含鹽分,可采用瓊脂擴(kuò)散法。用0.8%瓊脂鋪好的瓊脂塊,把含病毒的懸液滴到瓊脂塊上,然后把載網(wǎng)倒懸在這滴懸液上。瓊脂塊把水分吸收,濃縮的病毒沾附在載網(wǎng)上,再經(jīng)過負(fù)染色后進(jìn)行電鏡觀察。30高級培訓(xùn)3、假復(fù)型技術(shù):31高級培訓(xùn)方法:方法:32高級培訓(xùn)33高級培訓(xùn)4、病毒顆粒免疫電鏡技術(shù):、病毒顆粒免疫電鏡技術(shù):34高級培訓(xùn)樣品制備步驟:35高級培訓(xùn)36高級培訓(xùn)37高級培訓(xùn)