《生物化學實驗》全套課件-PPT

《《生物化學實驗》全套課件-PPT》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《《生物化學實驗》全套課件-PPT（189頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、 實驗一實驗一 生物化學實驗技能培訓生物化學實驗技能培訓 實驗二實驗二 蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實驗蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實驗 實驗三實驗三 Folin-wu Folin-wu法定量測定血糖的含量法定量測定血糖的含量 實驗四實驗四 Folin-Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)濃度酚試劑法測定蛋白質(zhì)濃度 實驗五實驗五 氨基酸的紙層析氨基酸的紙層析 實驗六實驗六 醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白 實驗七實驗七 胰蛋白酶的活力測定胰蛋白酶的活力測定 實驗八實驗八 酵母酵母RNARNA的提取及鑒定的提取及鑒定 實驗九實驗九 DNA DNA的定量測定的定量測定 實驗十實驗十 水果中維生素水果中維生素C C的

2、定量測定的定量測定 實驗十一實驗十一 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳牛血清聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳牛血清生物化學實驗技能培訓生物化學實驗技能培訓通過生物化學實驗應該做到：學習設計一個實驗的基本思路，掌握各個實驗的基本原理，學會嚴密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間。訓練實驗的動手能力，學會熟練地使用各種生物化學實驗儀器。學會準確翔實地記錄實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實驗報告的寫作能力，能夠整齊清潔地進行所有的實驗，培養(yǎng)嚴謹細致的科學作風。掌握生物化學的各種基本實驗方法和實驗技術(shù)，為今后參加科研工作打下堅實的基礎。實驗室規(guī)則實驗室規(guī)則 實驗前必須認真預習實驗內(nèi)容，明確本次實驗的目的和要求，掌握實驗原

3、理。實驗時自覺遵守實驗室紀律，保持室內(nèi)安靜，不大聲說笑和喧嘩。實驗過程中要聽從教師指導，認真按照實驗步驟和操作規(guī)程進行實驗。若想改進和設計新的實驗方法，必須取得教師的同意。實驗時認真進行實驗記錄，實驗完畢及時整理數(shù)據(jù)，按時上交實驗報告。實驗臺面、稱量臺、藥品架、水池以及各種實驗儀器內(nèi)外都必須保持清潔整齊，藥品稱完后立即蓋好瓶蓋放回藥品架，嚴禁瓶蓋及藥勺混雜，切勿使藥品（尤其是NaOH）灑落在天平和實驗臺面上，毛刷用后必須立即掛好，各種器皿不得丟棄在水池內(nèi)。配制試劑按實驗實際使用量配制，多余的重要試劑和各種有機試劑要按教師要求進行回收；昂貴試劑需要回收，不得丟棄。配制的試劑和實驗過程中的樣品，尤

4、其是保存在冰箱和冷室中的樣品，必須貼上標簽、寫上品名、濃度、姓名和日期等，放在冰箱中的易揮發(fā)溶液和酸性溶液，必須嚴密封口。強酸強堿以及其他實驗廢液必須倒入廢液桶。電泳后的凝膠和各種廢物不得倒入水池，只能倒入廢物桶。使用貴重精密儀器應嚴格遵守操作規(guī)程。使用分光光度計時不得將溶液灑在儀器內(nèi)外和地面上。儀器發(fā)生故障應立即報告教師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。實驗室內(nèi)嚴禁吸煙、飲水和進食，嚴禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液體不得接近明火和電爐，凡產(chǎn)生煙霧、有害氣體和不良氣味的實驗，均應在通風條件下進行。實驗完畢必須及時洗凈并放好各種玻璃儀器，插好自動部分收集器上的試管，保持實驗臺面和實驗柜內(nèi)的整潔。嚴禁抄

5、拿他組儀器，不得將器皿遺棄在分光光度計內(nèi)和其他實驗臺面上，打破了玻璃儀器要及時向教師報告，并自覺登記，學期結(jié)束時按規(guī)定進行處理。每日實驗完畢，值日生要認真做好實驗室的衛(wèi)生值日工作。最后離開實驗室的實驗人員，必須檢查并關(guān)好水、電、門、窗。蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實驗蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實驗 蛋白質(zhì)顏色反應和沉淀反蛋白質(zhì)顏色反應和沉淀反應應 蛋白質(zhì)分子中某種或某些集團可與顯色劑作用，蛋白質(zhì)分子中某種或某些集團可與顯色劑作用，產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應亦不完全相同。顏色反應不是蛋白質(zhì)的同，顏色反應亦不完全相同。顏色反應不是蛋白質(zhì)的專一反應

6、，一些非蛋白物質(zhì)也可產(chǎn)生同樣的顏色反應，專一反應，一些非蛋白物質(zhì)也可產(chǎn)生同樣的顏色反應，因此不能根據(jù)顏色反應的結(jié)果來決定被測物是否為蛋因此不能根據(jù)顏色反應的結(jié)果來決定被測物是否為蛋白質(zhì)。另外，顏色反應也可作為一些常用蛋白質(zhì)定量白質(zhì)。另外，顏色反應也可作為一些常用蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。測定的依據(jù)。第一部分第一部分 蛋白質(zhì)的顏色反應蛋白質(zhì)的顏色反應1 1、吸管、吸管 2 2、滴管、滴管 3 3、試管、試管 4 4、電爐、電爐 5 5、pHpH試紙試紙 6 6、水、水浴鍋浴鍋1 1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-2010-20倍，倍，3-43-4層紗布過濾，濾液

7、放層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。在冰箱里冷藏備用。2 2、0.5%0.5%苯酚：苯酚：1g1g苯酚加蒸餾水稀釋至苯酚加蒸餾水稀釋至200ml200ml。3 3、MillonsMillons試劑：試劑：40g40g汞溶于汞溶于60ml60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混勻，取上清夜備用。此試劑可長期保存。卻，加二倍體積的蒸餾水，混勻，取上清夜備用。此試劑可長期保存。4 4、1%CuSO1%CuSO4 4：1g CuSO1g CuSO4 4晶體溶于蒸餾水，稀釋至晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml100ml5 5、10%NaOH10%

8、NaOH：10g NaOH10g NaOH溶于蒸餾水，稀釋至溶于蒸餾水，稀釋至100ml100ml6 6、0.1%0.1%茚三酮溶液：茚三酮溶液：0.1g0.1g茚三酮溶于茚三酮溶于95%95%的乙醇并稀釋至的乙醇并稀釋至100ml.100ml.7 7、尿素晶體、尿素晶體 8 8、濃硝酸、濃硝酸 9 9、冰醋酸、冰醋酸 1010、濃硫酸、濃硫酸（一）米倫（一）米倫（MillonsMillons）反應）反應：米倫試劑是硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝：米倫試劑是硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物。他能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起酸汞的混合物。他能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起顏色反應。組成蛋白質(zhì)的氨

9、基酸中只有酪氨酸含苯酚顏色反應。組成蛋白質(zhì)的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基團，因此該反應為蛋白質(zhì)中酪氨酸存在的依據(jù)?；鶊F，因此該反應為蛋白質(zhì)中酪氨酸存在的依據(jù)。：1 1、苯酚實驗：、苯酚實驗：取取0.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液1ml1ml于試管中，加于試管中，加MillonsMillons試劑試劑0.5ml0.5ml，于電爐上小心加熱，溶液即出現(xiàn)玫瑰紅色。，于電爐上小心加熱，溶液即出現(xiàn)玫瑰紅色。2 2、蛋白質(zhì)實驗：、蛋白質(zhì)實驗：取取2ml2ml蛋白液，加蛋白液，加MillonsMillons試劑試劑0.5ml0.5ml，出現(xiàn)白色，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小心加熱，凝固的蛋白質(zhì)出現(xiàn)紅色。的蛋白質(zhì)沉淀

10、，小心加熱，凝固的蛋白質(zhì)出現(xiàn)紅色。（二）雙縮脲反應（二）雙縮脲反應：尿素被加熱，則兩分子的尿素放出一分子氨：尿素被加熱，則兩分子的尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紫色的化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子成紫色的化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能進行此反應。雙縮中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能進行此反應。雙縮脲反應可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。脲反應可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。：1 1、尿素實驗、尿素實驗取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱使其取少量尿素晶體放在干燥的試

11、管中，微火加熱使其熔化成液體，此時有氨氣放出，可用濕潤的試紙檢驗，熔化成液體，此時有氨氣放出，可用濕潤的試紙檢驗，至液體重新結(jié)晶出現(xiàn)白色固體時，停止加熱，冷卻。然至液體重新結(jié)晶出現(xiàn)白色固體時，停止加熱，冷卻。然后加后加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，搖勻，再加，搖勻，再加2-42-4滴滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液，溶液，混勻，觀察有無紫色出現(xiàn)?；靹颍^察有無紫色出現(xiàn)。2 2、蛋白液實驗、蛋白液實驗取蛋白液取蛋白液1ml1ml，加，加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，搖勻，再加，搖勻，再加2-42-4滴滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液，混勻，觀察有無

12、紫色出現(xiàn)。溶液，混勻，觀察有無紫色出現(xiàn)。（三）黃色反應（三）黃色反應：蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（如：蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應并生成黃色物酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應并生成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境下變?yōu)榻埸S色的硝基苯衍生物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境下變?yōu)榻埸S色的硝基苯衍生物硝醌酸等。硝醌酸等。：取一支試管，加入：取一支試管，加入1ml1ml蛋白液及濃硝酸蛋白液及濃硝酸5 5滴。加滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，顏色有什么變化？，顏色有什么變化？（四）

13、茚三酮反應（四）茚三酮反應：蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，產(chǎn)生蘭紫色的還原茚三：蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，產(chǎn)生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切蛋白質(zhì)及酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切蛋白質(zhì)及a-a-氨基氨基酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應呈黃色，含有氨基的其他物質(zhì)亦呈此反應。呈黃色，含有氨基的其他物質(zhì)亦呈此反應。：取蛋白液：取蛋白液1ml1ml于試管中，加于試管中，加4-84-8滴茚三酮溶液，加熱至滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)。沸，即有藍紫色出現(xiàn)。第二部分第二部分 蛋白質(zhì)的沉淀反應蛋白質(zhì)的沉淀反應蛋白質(zhì)是親水

14、性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點蛋白質(zhì)是親水性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，相對的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定相對的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當破。當破壞這兩個因素時，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。壞這兩個因素時，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。1 1、移液管、移液管 2 2、吸管、吸管 3 3、試管、試管 4 4、電爐、電爐1 1

15、、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-2010-20倍，倍，3-43-4層紗布過濾，濾液層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。放在冰箱里冷藏備用。2 2、飽和硫酸銨溶液：、飽和硫酸銨溶液：100ml100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。蒸餾水中加硫酸銨至飽和。3 3、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。4 4、95%95%乙醇。乙醇。5 5、醋酸鉛溶液：、醋酸鉛溶液：1g1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml100ml6 6、硫酸銅溶液：、硫酸銅溶液：1g CuSO1g CuSO4 4晶體溶于蒸餾水，稀釋至晶體溶于蒸餾水，

16、稀釋至100ml100ml7 7、氯化鈉晶體、氯化鈉晶體8 8、10%10%三氯乙酸溶液：三氯乙酸溶液：10g10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml100ml9 9、飽和苦味酸溶液：、飽和苦味酸溶液：100ml100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。蒸餾水中加苦味酸至飽和。1010、1%1%醋酸溶液。醋酸溶液。（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用一）蛋白質(zhì)的鹽析作用：向蛋白質(zhì)中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉：向蛋白質(zhì)中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)膠體顆粒脫水，破壞其水化或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶

17、的相反電層，同時它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所中和。于是穩(wěn)定因素被破壞，蛋白質(zhì)聚集荷的離子所中和。于是穩(wěn)定因素被破壞，蛋白質(zhì)聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質(zhì)變性。沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質(zhì)變性。：1 1、取試管、取試管1 1支，加蛋白液支，加蛋白液2ml2ml，然后加固體硫酸銨，然后加固體硫酸銨(加的過程要緩慢，加的量要少隨時搖勻），直至其飽加的過程要緩慢，加的量要少隨時搖勻），直至其飽和（大約為和（大約為50%50%）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。2 2、將上述混合液過濾。向濾液中逐漸加入少量固、將上述混合液過濾。向濾液中逐漸加入少

18、量固體硫酸銨（每次加入量約為米粒大小），邊加邊搖，體硫酸銨（每次加入量約為米粒大小），邊加邊搖，直至飽和為止，此時析出為清蛋白。再加入少量蒸餾直至飽和為止，此時析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。水，觀察沉淀是否溶解。（二）有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)（二）有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)：某些有機溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引：某些有機溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。：取一試管加蛋白液：取一試管加蛋白液1ml1ml

19、，加入晶體氯化鈉少許，加入晶體氯化鈉少許，待溶解后再加待溶解后再加95%95%乙醇乙醇3ml,3ml,搖勻，觀察現(xiàn)象。搖勻，觀察現(xiàn)象。（三）重金屬鹽與某些有機酸沉淀蛋白質(zhì)（三）重金屬鹽與某些有機酸沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子（如：重金屬離子（如PbPb2+2+、CuCu2+2+等）與蛋白質(zhì)的羧基等）與蛋白質(zhì)的羧基等結(jié)合生成不溶性的金屬鹽類而沉淀，同時蛋白質(zhì)發(fā)等結(jié)合生成不溶性的金屬鹽類而沉淀，同時蛋白質(zhì)發(fā)生變性。某些有機酸的酸根則與蛋白質(zhì)的自由氨基結(jié)生變性。某些有機酸的酸根則與蛋白質(zhì)的自由氨基結(jié)合而沉淀。合而沉淀。：1 1、取試管、取試管2 2支，各加蛋白液支，各加蛋白液2ml2ml，一支管中滴加，一

20、支管中滴加1%1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%1%硫酸銅溶液，至有硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。沉淀產(chǎn)生。（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)：植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為：植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應的物質(zhì)稱為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸等。當溶液生物堿試劑，如鞣酸等。當溶液PHPH小于等電點時，蛋白小于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負離子發(fā)生反應質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負離子發(fā)生反應而沉淀。而沉淀。：?。喝? 2支試

21、管，分別加入蛋白液支試管，分別加入蛋白液2ml2ml及醋酸及醋酸4-54-5滴，再滴，再加飽和苦味酸和鞣酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象加飽和苦味酸和鞣酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。（一）（一）米倫（米倫（MillonsMillons）反應）反應1 1、苯酚實驗：取、苯酚實驗：取0.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液1ml1ml于試管中，于試管中，加加MillonsMillons試劑試劑0.5ml0.5ml，電爐小心加熱觀，電爐小心加熱觀察顏色變化。察顏色變化。2 2、蛋白質(zhì)實驗：取、蛋白質(zhì)實驗：取2ml2ml蛋白液，加蛋白液，加MillonsMillons試劑試劑0.5ml0.5ml，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小，出現(xiàn)白色的蛋白

22、質(zhì)沉淀，小心加熱，觀察現(xiàn)象。心加熱，觀察現(xiàn)象。（二）（二）雙縮脲反應雙縮脲反應1 1、取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火、取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱熔化，至重新結(jié)晶時冷卻。然后加加熱熔化，至重新結(jié)晶時冷卻。然后加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，搖勻，再加，搖勻，再加2-42-4滴滴1%1%CuSOCuSO4 4溶液，混勻，觀察現(xiàn)象。溶液，混勻，觀察現(xiàn)象。2 2、取蛋白液、取蛋白液1ml1ml，加，加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，搖勻，搖勻，再加再加2-42-4滴滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液，混勻，觀察現(xiàn)溶液，混勻，觀察現(xiàn)象。象。（三

23、）（三）黃色反應黃色反應 取一支試管，加入取一支試管，加入1ml1ml蛋白液及濃硝酸蛋白液及濃硝酸5 5滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入加入10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，顏色有什么變化？，顏色有什么變化？（四）（四）茚三酮反應茚三酮反應 取蛋白液取蛋白液1ml1ml于試管中，加于試管中，加1010滴茚三酮溶滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)液，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)。1 1、取試管、取試管1 1支，加蛋白液支，加蛋白液2ml2ml，然后加，然后加固體硫酸銨固體硫酸銨(加的過程要緩慢，加的量加的過程要緩慢，加的量要少，隨時搖勻

24、），直至其飽和（大要少，隨時搖勻），直至其飽和（大約為約為50%50%）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。蛋白析出。蛋白質(zhì)的顏色反應蛋白質(zhì)的顏色反應蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀注意事項：1.吸取蛋白液的移液管必須專管專用，否則容易污染其他試劑。2.米倫試劑含有腐蝕性物質(zhì)，一定小心使用。3.電爐加熱試管時，試管口嚴禁朝向人。http:/222.195.234.199/openclass登錄名：自己的學號密碼：自己的學號大家先把電子版的實驗報告作好，然后在周五或周六以后再上傳文件實驗報告要求：1目的2原理3實驗儀器4實驗試劑5實驗步驟6實驗結(jié)果7實驗分析下次實驗：血糖的定量測

25、定-folin-wu法Folin-WuFolin-Wu法法定量測定血糖的含量定量測定血糖的含量1.1.氧化供能氧化供能 2.2.人體的主要組成成分之一人體的主要組成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；轉(zhuǎn)化成脂肪糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；轉(zhuǎn)化成脂肪和某些非必需氨基酸等和某些非必需氨基酸等3.3.糖代謝紊亂糖代謝紊亂供能障礙供能障礙一系列代謝變化一系列代謝變化 血糖：血糖：指血液中的單糖：葡萄糖指血液中的單糖：葡萄糖血糖水平：血糖水平：血漿中葡萄糖濃度血漿中葡萄糖濃度血糖總維持在恒定水平：血糖總維持在恒定水平：3.93.96.7mmol/L6.7mmol/L 臨床：臨床：血糖檢測是目前診斷

26、糖代謝異常相關(guān)疾病的血糖檢測是目前診斷糖代謝異常相關(guān)疾病的主要依據(jù)。主要依據(jù)?？蒲校嚎蒲校涸诖x疾病的研究中，常測定血糖。在某些在代謝疾病的研究中，常測定血糖。在某些藥物的研究中，也涉及血糖的測定。藥物的研究中，也涉及血糖的測定。v調(diào)節(jié)血糖水平的激素：調(diào)節(jié)血糖水平的激素：胰島素、胰高胰島素、胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素。血糖素、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素。v血糖水平異常：血糖水平異常：高血糖及糖尿?。桓哐羌疤悄虿?；低血糖低血糖 指空腹血糖濃度超過7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，臨床上最常見的病理性高血糖癥是糖尿病。是一種慢性、復雜的代謝紊亂性疾病,系胰島素絕對不足或相對不足，以高血糖

27、癥為基本生化特點。同時伴有糖、脂類、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂，甚至出現(xiàn)一系列并發(fā)癥如眼、腎的微血管病變及神經(jīng)病變等。癥狀隨機血漿葡萄糖癥狀隨機血漿葡萄糖 11.1mmol/L,11.1mmol/L,或空腹或空腹血漿葡萄糖血漿葡萄糖 7.0mmol/L 7.0mmol/L。癥狀不典型者需另。癥狀不典型者需另一天再次證實。隨機血糖是指一天中的任一時一天再次證實。隨機血糖是指一天中的任一時間采血測得的血糖濃度。間采血測得的血糖濃度。糖尿病典型的癥狀是糖尿病典型的癥狀是“三多一少三多一少”，即多飲、，即多飲、多尿、多食及消瘦多尿、多食及消瘦測定測定方法方法酶法：酶法：（1 1）己糖激酶法（）己

28、糖激酶法（HKHK）（2 2）葡萄糖氧化酶法（）葡萄糖氧化酶法（GODGOD法）法）特異性高，靈敏度高，干擾因素少特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動化適用于自動化分析，為葡萄糖測定的分析，為葡萄糖測定的參考方法參考方法，但是試劑較貴但是試劑較貴無機化學法：無機化學法：Folin-WuFolin-Wu法，特異性差法，特異性差有機化學法：有機化學法：鄰甲苯胺法、聯(lián)苯胺法、氨基聯(lián)苯法鄰甲苯胺法、聯(lián)苯胺法、氨基聯(lián)苯法干擾因素多干擾因素多 掌握掌握FolinFolinWuWu法測定血糖含量的原理和方法測定血糖含量的原理和方法。法。學會制備無蛋白血濾液。學會制備無蛋白血濾液。掌握掌握7200720

29、0型可見分光光度計的使用方法型可見分光光度計的使用方法。葡萄糖是一種多羥基的醛類化合物。其醛基具有還原性，葡萄糖是一種多羥基的醛類化合物。其醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧與堿性銅試劑混合加熱，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，基，CuCu2+2+即被葡萄糖還原成即被葡萄糖還原成CuCu+（CuCu2 2O O）而沉淀。）而沉淀。CuCu2+2+(CuSO(CuSO4 4)+)+葡萄糖葡萄糖 CuCu+（CuCu2 2O O）無蛋白血濾液中的葡萄糖和酸性鉬酸鹽溶液共熱反應無蛋白血濾液中的葡萄糖和酸性鉬酸鹽溶液共熱反應,CuCu2 2O O又把酸性鉬酸試劑（又把酸

30、性鉬酸試劑（MoMo6+6+）還原成低價的藍色鉬化合）還原成低價的藍色鉬化合物物鉬藍鉬藍 。CuCu2 2O+O+酸性鉬酸試劑酸性鉬酸試劑 藍色鉬化合物藍色鉬化合物 ODOD420420比色比色 血濾液中葡萄糖的含量與產(chǎn)生的血濾液中葡萄糖的含量與產(chǎn)生的CuCu2 2O O成正比，而成正比，而CuCu2 2O O的量的量與產(chǎn)生的鉬化合物的量成正比?？捎帽壬ǘ康臏y定。與產(chǎn)生的鉬化合物的量成正比?？捎帽壬ǘ康臏y定。1 1、25mL25mL血糖管血糖管3 3支；支；2 2、血糖管橡膠塞、血糖管橡膠塞3 3個；個；3 3、沸水浴小鍋、沸水浴小鍋1 1個；個；4 4、100mL100mL錐形瓶錐形

31、瓶2 2個；個；5 5、電爐、電爐1 1個；個；6 6、濾紙、濾紙1 1盒；盒；7 7、吸耳球、吸耳球2 2個；個；8 8、72007200型分光光度計型分光光度計1 1臺臺;血糖管血糖管7200型分光光度計型分光光度計 1 1、標準葡萄糖溶液（、標準葡萄糖溶液（0.1mg/ml0.1mg/ml）(1)1%(1)1%葡萄糖母液：稱取葡萄糖母液：稱取1.000g1.000g葡萄糖，溶于蒸餾水，稀釋并定容至葡萄糖，溶于蒸餾水，稀釋并定容至100ml100ml。(2)(2)葡萄糖標準液：取葡萄糖標準液：取1.0ml1.0ml葡萄糖母液于葡萄糖母液于100ml100ml容量瓶中，加蒸餾水定容。容量瓶中

32、，加蒸餾水定容。2 2、10%10%鎢酸鈉溶液：鎢酸鈉溶液：稱取鎢酸鈉稱取鎢酸鈉10g10g，溶于蒸餾水并定容至，溶于蒸餾水并定容至100100毫升。毫升。3 3、0.33mol/LH0.33mol/LH2 2SOSO4 4溶液：溶液：于于53ml53ml蒸餾水中加入蒸餾水中加入1ml1ml的濃硫酸。的濃硫酸。4 4、堿性硫酸銅溶液、堿性硫酸銅溶液 A A液：無水碳酸鈉液：無水碳酸鈉35g35g，酒石酸鈉，酒石酸鈉13g13g及碳酸氫鈉及碳酸氫鈉11g11g溶于蒸餾水，稀釋溶于蒸餾水，稀釋定容至定容至1000ml.1000ml.B B液：硫酸銅晶體液：硫酸銅晶體5g5g，溶于蒸餾水并定容至，溶

33、于蒸餾水并定容至100ml100ml。臨用時，臨用時，A A液：液：B B液液=9=9：1 1混合（體積比），混合液于冰箱中保存混合（體積比），混合液于冰箱中保存（44）。）。5 5、酸性鉬酸鹽溶液：、酸性鉬酸鹽溶液：稱取鉬酸鈉稱取鉬酸鈉600g,600g,用少量蒸餾水溶解后傾入用少量蒸餾水溶解后傾入2000ml 2000ml 的容量瓶中，加蒸的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，傾入另一較大的試劑瓶中，加溴水餾水至刻度，搖勻，傾入另一較大的試劑瓶中，加溴水0.5ml0.5ml，搖勻，搖勻，靜止數(shù)小時后取上清夜靜止數(shù)小時后取上清夜500ml500ml，于，于1000ml1000ml容量瓶中，徐徐加

34、入容量瓶中，徐徐加入225ml85%225ml85%磷酸，邊加邊搖勻，再加磷酸，邊加邊搖勻，再加25%25%硫酸硫酸150ml150ml。置暗處次日，用空氣將剩余的溴趕去。然后加置暗處次日，用空氣將剩余的溴趕去。然后加99%99%醋酸醋酸75ml75ml，搖勻，搖勻，用蒸餾水稀釋定容至用蒸餾水稀釋定容至1000ml,1000ml,貯于棕色瓶中。貯于棕色瓶中。1 1、無蛋白血濾液的制備、無蛋白血濾液的制備：用用5ml5ml移液管吸取全血（已加抗凝劑）移液管吸取全血（已加抗凝劑）1ml,1ml,緩緩緩緩放入放入100ml100ml錐形瓶中，加蒸餾水錐形瓶中，加蒸餾水7ml7ml，搖勻，溶血后（血，

35、搖勻，溶血后（血液變?yōu)榧t色透明）加液變?yōu)榧t色透明）加10%10%鎢酸鈉鎢酸鈉1ml1ml，搖勻，搖勻.。再加再加0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41ml1ml，邊加邊搖，加畢充分搖勻，邊加邊搖，加畢充分搖勻，放置放置5 51515分鐘，至沉淀變?yōu)榉昼姡脸恋碜優(yōu)榘底厣底厣ㄈ绮蛔兩稍伲ㄈ绮蛔兩稍偌蛹?.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41-21-2滴）。滴）。用用干濾紙干濾紙過濾。先傾入少許，待濾紙濕潤后在全部過濾。先傾入少許，待濾紙濕潤后在全部倒入，如濾液不清需重新過濾。每毫升無蛋白血濾倒入，如濾液不清需重新過濾。每毫升無蛋白血濾

36、液相當于液相當于1/10ml1/10ml全血。全血。2 2、血糖的定量測定：、血糖的定量測定：取取25ml25ml的血糖管的血糖管3 3支，編號。第一支血糖管中加入支，編號。第一支血糖管中加入2ml2ml蒸餾水蒸餾水（空白管）；第二支血糖管中加（空白管）；第二支血糖管中加2ml2ml標準葡萄糖液；用吸管標準葡萄糖液；用吸管吸取無蛋白血濾液吸取無蛋白血濾液2ml2ml，放入第三支血糖管中。，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入然后向三支血糖管中各加入2ml2ml新配制的堿性硫酸銅溶液，新配制的堿性硫酸銅溶液，同時置于沸水浴中同時置于沸水浴中8 8分鐘，取出，在流水中迅速冷卻后分鐘，取出，

37、在流水中迅速冷卻后,勿搖勿搖動動，各加，各加4ml4ml酸性鉬酸鹽溶液。酸性鉬酸鹽溶液。一分鐘后，用蒸餾水稀釋至一分鐘后，用蒸餾水稀釋至25ml25ml，混勻，用，混勻，用72007200分光光度計分光光度計在在420nm420nm波長處比色，以空白管調(diào)節(jié)零點。波長處比色，以空白管調(diào)節(jié)零點。按下式計算按下式計算100ml100ml全血中所含血糖的含量全血中所含血糖的含量m=Am=A1 1/A/A0 0C C0 00.1100100式中式中:m m=100ml=100ml全血中含血糖毫克數(shù)全血中含血糖毫克數(shù);C C0 0=標準液葡萄糖含量標準液葡萄糖含量（0.1mg/ml0.1mg/ml）；）；

38、A A1 1=樣品液光吸收值樣品液光吸收值;A A0 0=標準液光吸收值標準液光吸收值 0.10.1：1ml1ml無蛋白血溶液相對于無蛋白血溶液相對于0.1ml0.1ml全血全血空白管標準管（A0）樣品管（A1）OD4200OD4200OD4200OD平均01.1.加硫酸、鎢酸鈉時，要邊加邊搖勻加硫酸、鎢酸鈉時，要邊加邊搖勻2.2.沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣?，是因鎢酸鈉與硫酸生成鎢酸，在沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣?，是因鎢酸鈉與硫酸生成鎢酸，在適當酸度時，使血紅蛋白變性沉淀，如果沉淀不變暗棕色或適當酸度時，使血紅蛋白變性沉淀，如果沉淀不變暗棕色或重新過濾后仍混濁，是因為血液中所加抗凝劑過多，可以加重新過濾后

39、仍混濁，是因為血液中所加抗凝劑過多，可以加入入1010硫酸硫酸1-21-2滴，待暗棕色后再過濾。滴，待暗棕色后再過濾。3.3.用定量濾紙過濾后應該得到完全澄清無色之無蛋白血濾液。用定量濾紙過濾后應該得到完全澄清無色之無蛋白血濾液。如果得到仍帶有紅色的血濾液則說明蛋白質(zhì)未被完全去除。如果得到仍帶有紅色的血濾液則說明蛋白質(zhì)未被完全去除。1 1、實驗過程中那些操作可能影響實驗結(jié)果的、實驗過程中那些操作可能影響實驗結(jié)果的準確性？準確性？2 2、實驗中，血糖管有什么作用？、實驗中，血糖管有什么作用？3 3、實驗過程中，為什么要用流水冷卻加入堿、實驗過程中，為什么要用流水冷卻加入堿性硫酸銅液反應后的血糖管

40、？性硫酸銅液反應后的血糖管？1 1、無蛋白血濾液的制備、無蛋白血濾液的制備：蒸餾水蒸餾水7ml 7ml 搖勻搖勻 10%10%鎢酸鈉鎢酸鈉1ml 1ml 搖勻搖勻 0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41ml 1ml 邊加邊搖邊加邊搖,加畢充分搖勻加畢充分搖勻 放置放置515分分(沉淀變?yōu)榘底厣恋碜優(yōu)榘底厣?(如不變色如不變色,再加再加0.33mol/L H2SO412滴滴)干濾紙過濾干濾紙過濾 無蛋白血濾液無蛋白血濾液(每毫升相當于每毫升相當于1/10ml1/10ml全血全血)20ml20ml錐形瓶錐形瓶溶血溶血(變?yōu)榧t色透明變?yōu)榧t色透明)用用5ml5ml移液管取

41、全血移液管取全血1ml1ml（已加抗凝劑（已加抗凝劑2、血糖的定量測定：、血糖的定量測定：1 1號管號管2ml2ml蒸餾水蒸餾水2ml2ml新新配制的配制的堿性硫堿性硫酸銅溶酸銅溶液液同時置同時置于沸水于沸水浴中浴中8min8min，取出取出在流水在流水中迅速中迅速冷卻冷卻4ml4ml酸酸性鉬酸性鉬酸鹽溶液鹽溶液一分鐘一分鐘后，用后，用蒸餾水蒸餾水稀釋至稀釋至25ml25ml，混勻混勻用用72207220分分光光度計光光度計在在420420波長波長處比色處比色,以以空白管調(diào)空白管調(diào)節(jié)零點節(jié)零點2 2號管號管2ml2ml標準葡萄糖標準葡萄糖液液3 3號管號管2ml2ml無蛋白血濾無蛋白血濾液液m

42、=OD1/OD2 C 10 100朗伯定律朗伯定律：A=kA=k1 1L L 比爾定律比爾定律：A=kA=k2 2C C朗伯朗伯-比爾定律比爾定律：如同時考慮液：如同時考慮液層厚度和溶液濃度對吸光度層厚度和溶液濃度對吸光度的影響，則吸光度與溶質(zhì)的的影響，則吸光度與溶質(zhì)的濃度和溶液的厚度的乘積成濃度和溶液的厚度的乘積成正比。正比。A=KLC A=KLC A A標標=KC=KC標標L LA A樣樣=KC=KC樣樣L L 標準品法測定未知樣品含量標準品法測定未知樣品含量C C樣樣=A A樣樣A A標標C C標標連接儀器電源線，確定儀器供電電源有良好的接地性能。連接儀器電源線，確定儀器供電電源有良好的

43、接地性能。接通電源，使儀器預熱接通電源，使儀器預熱2020分鐘。分鐘。用用鍵設置測試方式：投射比（鍵設置測試方式：投射比（T T），吸光度（），吸光度（A A），），已知標準樣品濃度值方式（已知標準樣品濃度值方式（C C）和已知標準樣品斜率（）和已知標準樣品斜率（F F）方式。方式。用波長選擇旋鈕設置您所需的分析波長用波長選擇旋鈕設置您所需的分析波長。將參比樣品溶液和被測樣將參比樣品溶液和被測樣品溶液分別倒入比色皿中，品溶液分別倒入比色皿中，打開樣品室蓋，將盛有溶打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋。皿槽中，蓋上樣品室蓋。一般情況下，參比樣品放

44、一般情況下，參比樣品放在第二個槽位中。在第二個槽位中。將將0 0T T校具（黑體）置入校具（黑體）置入光路中，在光路中，在T T方式下按方式下按“0 0T”T”鍵，此時顯示器顯示鍵，此時顯示器顯示“000.0”000.0”按按 MODEMODE鍵選擇鍵選擇A A模式模式 將參比樣品拉入光路中，將參比樣品拉入光路中，按按“0A/1000A/100T”T”鍵調(diào)鍵調(diào)0A/1000A/100T T，此時顯示器，此時顯示器顯示的顯示的“BLA”BLA”直至顯示直至顯示“0.000”A0.000”A為止。為止。當儀器顯示器顯示出當儀器顯示器顯示出“0.000”A0.000”A后，將被測樣后，將被測樣品推入

45、光路，這時，您便品推入光路，這時，您便可從顯示器上得到被測樣可從顯示器上得到被測樣品的吸光度。品的吸光度。比色皿的清潔程度，直接影響實驗結(jié)果。因此，特比色皿的清潔程度，直接影響實驗結(jié)果。因此，特別要將比色皿清洗干凈。別要將比色皿清洗干凈。裝樣前處理：自來水反復沖洗裝樣前處理：自來水反復沖洗蒸餾水漂洗蒸餾水漂洗2 2次次待裝溶液漂洗待裝溶液漂洗2 2次。次。用完后用自來水和蒸餾水洗凈并用檫鏡紙檫干放回用完后用自來水和蒸餾水洗凈并用檫鏡紙檫干放回比色皿盒中。比色皿盒中。拿放比色皿時，應持其拿放比色皿時，應持其“毛面毛面”，不要接觸，不要接觸“光面光面”。光面光面毛面毛面若比色皿外表面有液體，應用擦

46、鏡紙朝同一方向拭干，若比色皿外表面有液體，應用擦鏡紙朝同一方向拭干，以保證吸光度測量不受影響。以保證吸光度測量不受影響。比色皿內(nèi)盛液應為其容量的比色皿內(nèi)盛液應為其容量的2/32/3，過少會影響實驗結(jié)，過少會影響實驗結(jié)果，過多易在測量過程中外溢，污染儀器。果，過多易在測量過程中外溢，污染儀器。容容量量的的2/32/3 比色皿的光面要與光源在一條線上。比色皿的光面要與光源在一條線上。光透過窗口光透過窗口福林福林(Folin)-(Folin)-酚試劑法測定酚試劑法測定蛋白質(zhì)的濃度蛋白質(zhì)的濃度 蛋白質(zhì)的定量分析蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學和其它生命是生物化學和其它生命學科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷

47、學科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復情況的重要指標，也是許疾病及檢查康復情況的重要指標，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測的重要多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標。指標。在生化實驗中，對樣品中的蛋白質(zhì)進行準在生化實驗中，對樣品中的蛋白質(zhì)進行準確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進行的一項確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進行的一項非常重要的工作非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白能各異，這樣就給建立一個理想而又

48、通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來了許多具體的困難。目前質(zhì)定量分析的方法代來了許多具體的困難。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：物理性質(zhì)物理性質(zhì)：紫外分光光度法：紫外分光光度法化學性質(zhì)化學性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry Lowry 法，法，BCABCA法，膠體金法法，膠體金法染色性質(zhì)染色性質(zhì)：考馬氏亮藍染色法、銀染法：考馬氏亮藍染色法、銀染法其他性質(zhì)其他性質(zhì)：熒光法：熒光法方方 法法測定范圍測定范圍（g/mlg/ml）不同不同種類種類

49、蛋白蛋白的差的差異異最大最大吸收吸收波長波長(nm)(nm)特特 點點凱氏定氮凱氏定氮法法 小小 標準方法，準確，操作麻煩，費時，靈敏標準方法，準確，操作麻煩，費時，靈敏度低，適用于標準的測定度低，適用于標準的測定紫外分光紫外分光光度法光度法10010010001000大大280280205205靈敏，快速，不消耗樣品，核酸類物質(zhì)有靈敏，快速，不消耗樣品，核酸類物質(zhì)有影響影響雙縮脲法雙縮脲法100010001000010000小小540540重復性、線性關(guān)系好，靈敏度低，測定范重復性、線性關(guān)系好，靈敏度低，測定范圍窄，樣品需要量大圍窄，樣品需要量大Folin-Folin-酚酚試劑法試劑法202

50、0500500大大750750靈敏，費時較長，干擾物質(zhì)多靈敏，費時較長，干擾物質(zhì)多考馬氏亮考馬氏亮藍藍G-250G-2505050500500大大595595靈敏度高，穩(wěn)定，誤差較大，顏色會轉(zhuǎn)移靈敏度高，穩(wěn)定，誤差較大，顏色會轉(zhuǎn)移BCABCA5050500500大大562562靈敏度高，穩(wěn)定，干擾因素少，費時較長靈敏度高，穩(wěn)定，干擾因素少，費時較長蛋白質(zhì)不同方法比較蛋白質(zhì)不同方法比較蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物）。

51、藍色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正成鉬藍和鎢藍化合物）。藍色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色法測定。比，可用比色法測定。此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數(shù)量級，較此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數(shù)量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在1515分鐘有最大顯色，分鐘有最大顯色，并最少可穩(wěn)定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有并最少可穩(wěn)定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會影響測定結(jié)果的準確性。較多種類的物質(zhì)都會影響測定結(jié)果的準確性。1.1.卵清蛋白片卵清蛋白片 2.72002.7200分光光度計分光光度計3.3.試管試管 4.4.移

52、液管移液管1.Folin-1.Folin-酚試劑酚試劑A A：堿性銅溶液：堿性銅溶液 甲液：取甲液：取Na2CO32gNa2CO32g溶于溶于100ml0.1mol/l100ml0.1mol/l氫氧化鈉溶液中氫氧化鈉溶液中 乙液：取乙液：取CuSO4.5H2OCuSO4.5H2O晶體晶體0.5g0.5g，溶于，溶于1%1%酒石酸鉀酒石酸鉀100ml100ml中。中。臨用時按甲：乙臨用時按甲：乙=50=50：1 1混合使用?；旌鲜褂?。2.Folin-2.Folin-酚試劑酚試劑B B：將：將100g100g鎢酸鈉、鎢酸鈉、25g25g鉬酸鈉、鉬酸鈉、700ml700ml蒸餾水、蒸餾水、50ml8

53、5%50ml85%磷磷酸繼酸繼100ml100ml濃鹽酸置于濃鹽酸置于1500ml1500ml的磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上的磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上磨口冷凝管，回餾磨口冷凝管，回餾1010小時，再加入硫酸鋰小時，再加入硫酸鋰150g150g，蒸餾水，蒸餾水50ml50ml及液溴數(shù)及液溴數(shù)滴，開口煮沸滴，開口煮沸1515分鐘，在通風櫥內(nèi)驅(qū)除過量的溴。冷卻，稀釋至分鐘，在通風櫥內(nèi)驅(qū)除過量的溴。冷卻，稀釋至1000ml1000ml，過濾，濾液成微綠色，貯于棕色瓶中。臨用時，用，過濾，濾液成微綠色，貯于棕色瓶中。臨用時，用1mol/l1mol/l的的氫氧化鈉溶液滴定，用酚酞作指示劑，根據(jù)

54、滴定結(jié)果，將試劑稀釋至氫氧化鈉溶液滴定，用酚酞作指示劑，根據(jù)滴定結(jié)果，將試劑稀釋至相當于相當于1mol/L1mol/L的酸。的酸。3.1mg/mL3.1mg/mL牛血清蛋白液：稱取牛血清蛋白液：稱取1g1g牛血清蛋白片溶于牛血清蛋白片溶于0.9%0.9%氯化鈉溶液中，并氯化鈉溶液中，并稀釋至稀釋至 1000ml1000ml1.1.標準曲線的繪制標準曲線的繪制 取取7 7支干燥的試管，編號，按下表加入試劑，支干燥的試管，編號，按下表加入試劑，比色后，以光密度為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度為橫坐比色后，以光密度為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標作圖。標作圖。2.2.樣品測定樣品測定 準確吸取樣液準確吸取樣液0.5

55、ml0.5ml于干燥的試管中，同樣按下于干燥的試管中，同樣按下表加入試劑，測出光密度值后，對照標準曲線求表加入試劑，測出光密度值后，對照標準曲線求出樣液的蛋白質(zhì)濃度。出樣液的蛋白質(zhì)濃度。管號管號1 12 23 34 45 56 67 7樣品樣品牛血清蛋白液牛血清蛋白液(1mg/ml)ml(1mg/ml)ml蒸餾水蒸餾水mlmlFolin-Folin-酚試劑酚試劑A A0 00.50.54.04.00.050.050.450.454.04.00.10.10.40.44.04.00.20.20.30.34.04.00.30.30.20.24.04.00.40.40.10.14.04.00.50.5

56、0 04.04.00.50.5（樣液）（樣液）0 04.04.0搖勻，在室溫下放置搖勻，在室溫下放置1010分鐘分鐘Folin-Folin-酚試劑酚試劑B B0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5搖勻，在室溫下放置搖勻，在室溫下放置3030分鐘后在分鐘后在640nm640nm下比色下比色OD640OD6401 1、TrisTris緩沖液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚類、緩沖液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚類、檸檬酸以及高濃度的尿素、胍、硫酸鈉、三氯乙檸檬酸以及高濃度的尿素、胍、硫酸鈉、三氯乙酸、乙醇、丙酮酸、乙醇、丙酮等均會干擾等均會干擾Fol

57、in-Folin-酚反應。酚反應。2 2、當酚試劑加入后，應迅速搖勻（加、當酚試劑加入后，應迅速搖勻（加管搖一管）管搖一管）以免出現(xiàn)渾濁。以免出現(xiàn)渾濁。3 3、由于這種呈色化合物組成尚未確立，它在可見光、由于這種呈色化合物組成尚未確立，它在可見光紅外光區(qū)呈現(xiàn)較寬吸收峰區(qū)。不同實驗室選用不紅外光區(qū)呈現(xiàn)較寬吸收峰區(qū)。不同實驗室選用不同波長，有選用同波長，有選用500500或或 540nm540nm，有選用，有選用640nm640nm，700700或或750nm750nm。選用較高波長，樣品呈現(xiàn)較大的光吸收，。選用較高波長，樣品呈現(xiàn)較大的光吸收，本實驗選用波長本實驗選用波長640nm640nm。蛋白

58、質(zhì)含量測定的方法有哪些，各有什么優(yōu)缺點？蛋白質(zhì)含量測定的方法有哪些，各有什么優(yōu)缺點？1 1、將濃度和所測、將濃度和所測ODOD值輸入到值輸入到EXCELEXCEL表中。表中。2 2、將數(shù)據(jù)區(qū)域全部、將數(shù)據(jù)區(qū)域全部選中。選中。3 3、點擊、點擊“圖表向?qū)D表向?qū)А辨I。鍵。4 4、在圖標類型中選擇、在圖標類型中選擇“XY“XY散點圖散點圖”，然后點，然后點擊第一個圖。擊第一個圖。5.5.點擊點擊“下一步下一步”。6 6、在、在“圖表選項圖表選項”的的“標題標題”中，于選中的中，于選中的紅色區(qū)域內(nèi)可以填入相紅色區(qū)域內(nèi)可以填入相應的名稱。然后點擊應的名稱。然后點擊“完成完成”。7 7、鼠標點住數(shù)值點，

59、右鍵單擊，選擇、鼠標點住數(shù)值點，右鍵單擊，選擇”添加趨勢線添加趨勢線”8 8、在、在“添加趨勢線添加趨勢線”對對話框中選擇話框中選擇“線性線性”分析分析類型，然后點類型，然后點“確定確定”。9 9、點住直線右鍵單擊，、點住直線右鍵單擊，點點“趨勢線格式趨勢線格式”，對，對標準曲線進行編輯。標準曲線進行編輯。1010、在、在“選項選項”中勾選中勾選“顯示公式顯示公式”和和“顯示顯示R R平方值平方值”兩項，點兩項，點“確定確定”1111、曲線上會顯示出此標、曲線上會顯示出此標準曲線的回歸方程和準曲線的回歸方程和R R2 2，將樣品測得的將樣品測得的ODOD值（即值（即Y Y值）值）代入方程，就得

60、出樣品的代入方程，就得出樣品的濃度（即濃度（即X X值）。值）。這里的這里的R R2 2表示標準曲表示標準曲線的線性，即線的線性，即R R2 2越接近于越接近于1 1，你所測的數(shù)值越準確，也你所測的數(shù)值越準確，也越具有說服力。一般要求越具有說服力。一般要求至少至少R R2 2=0.99=0.99以上為好。以上為好。氨基酸的紙層析氨基酸的紙層析層析技術(shù)層析技術(shù)(chromatography(chromatography）也稱色譜技術(shù)，是一種）也稱色譜技術(shù)，是一種利用混合物中諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方利用混合物中諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。法。具體的說是根據(jù)被分離的混合物

61、中各組分的具體的說是根據(jù)被分離的混合物中各組分的理化性質(zhì)理化性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分在分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相兩相（一相為固定的，（一相為固定的，稱為稱為固定相固定相；另一相流過固定相，稱為；另一相流過固定相，稱為流動相流動相）中進行分）中進行分配以獲得分離的方法。配以獲得分離的方法。：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上

62、的溶以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液）。液）。：在層析過程中，推動固定相上待分離的物：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)移動的液體、氣體等，都稱為流動相。質(zhì)移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。二、層析技術(shù)的原理二、層析技術(shù)的原理 層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，另技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，另一是流動相。一是流動相。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組當待分

63、離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量比）不解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量比）不同，且隨流動相向前移動，各組分不斷地在兩相中進行再同，且隨流動相向前移動，各組分不斷地在兩相中進行再分配。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，分配。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的。從而達到將各組分分離的目的。三、發(fā)展簡史發(fā)展簡史層析分離技術(shù)在層析分離技術(shù)在2020世紀初就已得到應用：世紀初就已得到應用：19

64、031903年用于植物色素的分離年用于植物色素的分離,各種色素以不同的速率流各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法色譜法”19311931年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體；年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體；19441944年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析；年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析；2020世紀六十年代末出現(xiàn)了高效液相色譜世紀六十年代末出現(xiàn)了高效液相色譜(HPLC)(HPLC)。四、層析技術(shù)的種類四、層析技術(shù)的種類按層析的機理劃分：按層析的機理劃分：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、吸附

65、層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。親和層析等。吸附層析吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。達到分離鑒定的目的。分配層析分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。數(shù)不同，使之分離。離子交換層析離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。用的不同。按流動相與固定相的不同劃分按流動

66、相與固定相的不同劃分：氣相層析、液相層析。氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區(qū)分流動這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區(qū)分流動相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。液液層析等。按操作形式劃分按操作形式劃分：柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。紙層析紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。以達到分離鑒定的目的。薄層層析薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。1 1、通過氨基酸的分離，學習并掌握紙層析的原理、通過氨基酸的分離，學習并掌握紙層析的原理和操作技術(shù)；和操作技術(shù)；2 2、掌握分配層析法；、掌握分配層析法；3 3、掌握影響分配系數(shù)的因素。、掌握影響分配系數(shù)的因素。紙層析法：紙層析法：是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。是以濾紙作為惰性支持物的分配層析