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1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),藺帥 2013年4月,1,.,主要內(nèi)容,2,.,細(xì)胞簡介,細(xì)胞是生命活動的基本單位 1665年英國學(xué)者Robert Hooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞.,3,.,細(xì)胞簡介,細(xì)胞是生命活動的基本單位 1983-39德國植物學(xué)家施萊登和動物學(xué)家施旺確立了“細(xì)胞學(xué)說”的基本原則 1、細(xì)胞是有機(jī)體，動植物都是由細(xì)胞發(fā)育來的 2、每個細(xì)胞都作為一個相對的獨(dú)立單位，有自己的“生命” 3、新的細(xì)胞可以通過老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生,4,.,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺,5,.,細(xì)胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)
2、 的含義，簡單地說即是把來自機(jī)體的組織經(jīng)分散成為單個細(xì)胞，放在類似于體內(nèi)的體外環(huán)境中生存，使其不斷生長、繁殖或傳代，借以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng),6,.,細(xì)胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,原代培養(yǎng) 用直接從機(jī)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。,7,.,細(xì)胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,傳代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個培養(yǎng)
3、瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代，而懸浮型生長細(xì)胞則用直接傳代法或離心法傳代。,8,.,HEK293T和HEK293細(xì)胞,HEK293細(xì)胞簡介,HEK293細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài),9,.,HEK293T和HEK293細(xì)胞,HEK293細(xì)胞簡介 HEK293細(xì)胞株是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人胚腎上皮細(xì)胞，由于容易轉(zhuǎn)染且容易培養(yǎng)，常被用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。,10,.,HEK293T和HEK293細(xì)胞,瞬時轉(zhuǎn)染 在瞬時轉(zhuǎn)染中重組DNA導(dǎo)入感染性強(qiáng)的細(xì)胞系已獲得目的基因暫時但高水平的表達(dá)。轉(zhuǎn)染的DNA不必整合進(jìn)宿主染色體，當(dāng)用
4、大量的樣品需要在短時間內(nèi)分析時，尤其是在轉(zhuǎn)然后的1-4天內(nèi)收獲細(xì)胞，所得的溶解產(chǎn)物用于檢測目的基因的表達(dá)，可以采用瞬時表達(dá)的方式。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 這種細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染的目的基因整合到宿主染色體DNA中并指導(dǎo)適量的目的蛋白的合成。一般來說轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率要比瞬時轉(zhuǎn)染的效率低1-2個數(shù)量級。,11,.,HEK293細(xì)胞,HEK293細(xì)胞生長條件 完全培養(yǎng)基 10%的胎牛血清 DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺 4500mg/ml葡萄糖 ) 1%雙抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin) 37 5%CO2,12,.,無菌技術(shù),制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序（準(zhǔn)
5、備好實(shí)驗(yàn)過程中的一切用品） 洗手和著裝（75%酒精消毒） 進(jìn)入超凈臺中的所有物品均需消毒 操作野消毒,13,.,細(xì)胞培養(yǎng)耗材,14,.,HEK293細(xì)胞的傳代,待細(xì)胞的融合率達(dá)到90%時進(jìn)行傳代。 棄去舊細(xì)胞液 4遇冷的DPBS（不含Ca2+ 、Mg2+）4ml沖洗后棄液 加入0.05%（37 預(yù)溫 ）胰酶消化 加入12ml完全培養(yǎng)基（37 預(yù)溫 ）將細(xì)胞從細(xì)胞瓶底部沖下 1:4傳代即取3ml細(xì)胞懸液加入有9ml完全培養(yǎng)基的新細(xì)胞瓶中 放入37、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng),15,.,HEK293細(xì)胞的傳代,加入0.05%胰酶消化,16,.,HEK293細(xì)胞的傳代,17,.,HEK293細(xì)胞的凍存,隨著
6、傳代的次數(shù)增加，293細(xì)胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細(xì)胞購進(jìn)時就進(jìn)行大量凍存，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。 在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。 原則：慢凍,18,.,HEK293細(xì)胞的凍存,凍存前的準(zhǔn)備 DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗(yàn)前置室溫下。 0.05%的胰酶消化液：37預(yù)溫。 程序凍存盒（加250ml異丙醇）、二甲基亞砜(DMSO)、2ml細(xì)胞凍存管（標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期）、DPBS（不含鈣鎂）,19,.,HEK293細(xì)胞的凍存,凍存前的準(zhǔn)備,20,.,HEK293細(xì)胞凍存步驟,配制細(xì)胞凍存液 取50ml無菌離心管，于超凈臺內(nèi)，加入適量DMEM
7、培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置室溫下待用。,21,.,HEK293細(xì)胞凍存步驟,取準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，以DPBS2-3ml洗細(xì)胞一次,加入0.5-1.0ml 0.05%的胰酶消化,加入新鮮培養(yǎng)基10-12ml吹打成細(xì)胞懸液,收集細(xì)胞懸液至50ml無菌離心管，1000rpm，5min離心.棄上清，加入適量培養(yǎng)基,取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，DMSO最后濃度為10%,22,.,HEK293細(xì)胞凍存步驟,細(xì)胞濃度為15106cells/ml（細(xì)胞計(jì)數(shù)），分裝于已標(biāo)示完全之細(xì)胞凍存管中,將細(xì)胞凍存管放入程序凍
8、存盒中（已加250ml異丙醇），置-80超低溫冰箱,第二天將細(xì)胞放入液氮灌，并記錄,23,.,HEK293細(xì)胞凍存步驟,細(xì)胞凍存的注意事項(xiàng) 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài) 冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，以小體積分裝，4避光保存 低溫?fù)p傷主要發(fā)生在0-60這一溫度區(qū)內(nèi)，這一溫度范圍內(nèi)不宜過久,24,.,HEK293細(xì)胞的復(fù)蘇,當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多(超過50代)，細(xì)胞狀態(tài)變差時或細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對開始凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇 原則：快復(fù),25,.,HEK293細(xì)胞的復(fù)蘇,復(fù)蘇前的準(zhǔn)備 DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗(yàn)前置室溫下 將水浴鍋預(yù)熱至
9、37 取新培養(yǎng)瓶（75cm2），標(biāo)記細(xì)胞編號、時間，加入10ml DMEM培養(yǎng)基(37預(yù)熱)，潤濕底面,26,.,HEK293細(xì)胞復(fù)蘇步驟,根據(jù)凍存記錄從液氮灌中取出凍存的細(xì)胞,迅速投入已經(jīng)預(yù)熱至37 的水浴鍋中，并快速晃動，在1-2 min內(nèi)使完全融化,用酒精擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)，有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶,輕輕混勻，置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液,27,.,細(xì)胞培養(yǎng)的常見問題與解決方案,一、細(xì)胞培養(yǎng)污染問題 二、何時須更換培養(yǎng)基 三、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基 四、細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO,28,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞污染 細(xì)胞培養(yǎng)中最大
10、的敵人污染 包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞,29,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞污染的原因 無菌操作技術(shù)不當(dāng) 操作室環(huán)境不佳 培養(yǎng)基或者血清的污染,30,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞的細(xì)菌污染 最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以。革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、假單胞菌等。其中又以白色葡萄球菌較常見。 細(xì)菌污染后，會很快出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有少數(shù)培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。,31,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞的細(xì)菌污染檢測 16S RNA PCR法,32,.,細(xì)胞污染問題與解決
11、方案,常見的細(xì)菌污染,白色鏈球菌污染以及革蘭氏染色圖片,33,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞的真菌污染 梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。 真菌污染后，霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。,34,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞的真菌污染檢測 鏡檢有絲狀物,35,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,常見的真菌污染,真菌污染,霉菌污染,36,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞的支原體污染 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題 細(xì)胞被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋
12、白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。,37,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞的支原體污染檢測 試劑盒檢測法： 目前已有專門做支原體檢測的試劑盒，可以用細(xì)胞滴片進(jìn)行檢測 間接免疫熒光法和免疫印跡：簡便、快速、特異性,38,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,常見的支原體污染,支原體污染的電鏡下圖片,39,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞污染的解決方法 控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作 原則上棄掉 加抗生素 污染后清除用藥需采用大于常用量510倍的沖洗法，于加藥后作用2448小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。,40,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞污染
13、的解決方法 加抗生素,41,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,何時需更換細(xì)胞液 視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可,42,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,何時需更換細(xì)胞液 視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可,43,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基 不能，每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無法存活,44,.,細(xì)胞污染問題與解決方案,細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO 除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之
14、細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。,45,.,細(xì)胞間的操作注意事項(xiàng),未經(jīng)許可，任何人不得進(jìn)入細(xì)胞間。 不得在細(xì)胞間內(nèi)做任何與試驗(yàn)無關(guān)之事。 不得攜帶任何與實(shí)驗(yàn)無關(guān)或可能導(dǎo)致污染的物品進(jìn)入細(xì)胞間。 必須隨時保持細(xì)胞間的整潔、衛(wèi)生，及時清理雜物、垃圾。 所有設(shè)備、物品，使用后必須及時歸位。 進(jìn)入細(xì)胞間必須更換細(xì)胞間專用拖鞋與工作服。不得將細(xì)胞間專用拖鞋與工作服傳出細(xì)胞間外。 進(jìn)入細(xì)胞間必須養(yǎng)成隨手關(guān)門習(xí)慣。操作期間，細(xì)胞間外門
15、和中門必須處于關(guān)閉狀態(tài)。,,.,46,細(xì)胞間的操作注意事項(xiàng),操凈工作臺實(shí)驗(yàn)前和試驗(yàn)后的滅菌，打開紫外燈15-20分鐘。 試驗(yàn)操作期間，應(yīng)戴手套。并注意隨時用75%酒精消毒雙手。 實(shí)驗(yàn)操作期間，操凈工作臺的風(fēng)機(jī)應(yīng)處于打開狀態(tài)。操作結(jié)束后，關(guān)閉擋板、關(guān)閉風(fēng)機(jī)。 凡是帶入操凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶等到額瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置顯微鏡前，用75%酒精擦拭消毒載物臺 使用二氧化碳培養(yǎng)箱時，應(yīng)盡量縮短開門時間，減少開門次數(shù)。 每次倒置顯微鏡觀察細(xì)胞后，用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，再放入放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。,,.,47,細(xì)胞間的操作注意事項(xiàng),每一個人操作結(jié)
16、束后，必須及時清理操凈工作臺內(nèi)的物品，不得在工作臺內(nèi)留置或堆積雜物。 清理操凈工作臺后，用75%酒精擦拭消毒操凈工作臺面。 每一個操作結(jié)束后，必須及使用84消毒液消毒管道，并清理廢液瓶，及時棄去廢液。 操作結(jié)束后，確認(rèn)倒置顯微鏡電源關(guān)閉。 操作結(jié)束后，確認(rèn)二氧化碳培養(yǎng)箱的兩道門均處于關(guān)閉狀態(tài)。 離開細(xì)胞間前，確認(rèn)空調(diào)已關(guān)閉（夏季高溫季節(jié)除外）。 每日最后一人離開細(xì)胞間前，打開紫外燈消毒。 進(jìn)入或離開細(xì)胞間時，注意觀察二氧化碳鋼瓶上的壓力表壓力是否正常（減壓閥出氣口的壓力應(yīng)在0.06-0.08Mpa之間）。 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加。 定期打掃細(xì)胞間：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、操凈工作臺等，然后用3蘇爾或者新潔爾滅或者5%過氧乙酸擦拭,48,.,Thank You !,49,.,
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