《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講稿課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講稿課件（94頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、1,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 2008年12月 鄭州,中國藥品生物制品檢定所 蔡 彤,2,一、背景介紹,熱原 細(xì)菌內(nèi)毒素 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機(jī)理,3,熱原,熱原是指臨床上引起哺乳動物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì) 細(xì)胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 內(nèi)源性熱原 產(chǎn)生細(xì)胞分裂素的物質(zhì) 內(nèi)毒素?zé)嵩?外源性熱原 非內(nèi)毒素?zé)嵩ú《?、?xì)菌、真 菌、抗體-抗原復(fù)合物、細(xì)胞分裂素）,4,細(xì)菌內(nèi)毒素,細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分之一 化學(xué)結(jié)構(gòu) 含有3個不同的區(qū)域 O-特異側(cè)鏈 核心多糖 類脂A,5,細(xì)菌內(nèi)毒素,致熱性 內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)原 性熱原，再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞， 引
2、起發(fā)熱反應(yīng) 耐熱性 分子極性 多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性 在水中呈不均勻分布 酸堿性與 強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解反應(yīng) 鱟反應(yīng)性,6,C因子,活化的C因子,內(nèi)毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝膠）,凝固蛋白原,二價陽離子,(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM,活化的G因子,G因子,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機(jī)理,能與鱟的血液提取物可發(fā)生發(fā)生多級酶促反應(yīng)，形成凝膠,7,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機(jī)理,在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）條件下進(jìn)行藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制，一般可以接受的觀點(diǎn)是，不存在內(nèi)毒素就意味著不存在熱原 通過檢測內(nèi)毒素控制藥品中的熱原,8,Boc-leu-Gly-Arg-PNA （
3、鱟三肽）,活化的C因子,C因子,內(nèi)毒素,活化的B因子,B因子,顯色法,凝膠法，濁度法,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝膠）,凝固蛋白原,9,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法定義： 本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。,二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法介紹,10,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括： 限量實(shí)驗(yàn) 凝膠法 半定量實(shí)驗(yàn) 可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。,濁度法 動態(tài)濁度法 光度測定法 終點(diǎn)濁度法 顯色基質(zhì)法 動態(tài)顯色法 終點(diǎn)顯色法,二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法介紹,11,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 凝 膠 法,12,細(xì)菌內(nèi)毒
4、素檢查-凝膠法,1、綜述部分 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 限值（L）的確定 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,2、實(shí)驗(yàn)部分 鱟試劑靈敏度復(fù)核 干擾實(shí)驗(yàn)：預(yù)實(shí)驗(yàn) 正式干擾實(shí)驗(yàn) 檢 查 法：限量試驗(yàn) 半定量試驗(yàn),13,C因子,活化的C因子,內(nèi)毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白原,凝固蛋白（凝膠）,二價陽離子,1、凝膠法實(shí)驗(yàn)原理,14,37 1下保溫反應(yīng)602分鐘 當(dāng)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度達(dá)到或超過鱟試劑的靈敏度時，凝集為堅(jiān)實(shí)凝膠，為陽性，記為“+”。 當(dāng)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度未達(dá)到鱟試劑的靈敏度時，不能凝集為堅(jiān)實(shí)凝膠，為陰性，記為“”。,1、凝膠法實(shí)驗(yàn)原理,15,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,實(shí)
5、驗(yàn)所需物品 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 凝膠法鱟試劑 漩渦混合器 適宜的恒溫器 37 1 電熱干燥箱 250 實(shí)驗(yàn)器械等,16,細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 國家標(biāo)準(zhǔn)品 以內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價 150600-200707 10000EU/支 工作標(biāo)準(zhǔn)品 以內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價 150601-200862 120EU/支,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,17,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 用于復(fù)溶內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋內(nèi)毒素及樣品、溶解鱟試劑等 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,18,凝膠法鱟試劑 8個鱟試劑廠家 靈敏度0.50.
6、03EU/ml 規(guī)格0.5ml、0.1ml等,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,19,漩渦混合器,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,20,適宜的恒溫器 恒溫水浴 恒溫培養(yǎng)箱 干熱恒溫器,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,21,試驗(yàn)器械的要求 移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無熱原吸頭）、凝集管（1075mm）、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計(jì)時器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。 試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250干烤至少60分鐘，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,22,試驗(yàn)器械的要求 若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無
7、內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器械。 試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,23,供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。 一般要求供試品溶液的pH值在6.08.0的范圍內(nèi)。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。 緩沖液必須經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,24,3、限值（L）的確定,中國藥典標(biāo)準(zhǔn)、國家藥品標(biāo)準(zhǔn) 藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定： L=K/M,25,3、限值（L）的確定,L=K/M L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限
8、值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/kg/h表示。其中注射劑，K5EU/kg/h；放射性藥品注射劑，K2.5EU/kg/h；鞘內(nèi)用藥品，K=0.2EU/kg/h。 M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml/kg/h、mg/kg/h、U/kg/h表示。藥品人用最大劑量可參閱臨床用藥須知或藥品使用說明書。 中國人均體重按60kg計(jì)算，注射時間小于1小時的按1小時計(jì)。,26,3、限值（L）的確定,計(jì)算舉例： 注射用阿莫西林鈉 根據(jù)國家藥典委員會編纂的臨床用藥須知: “肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次0.51g，一日34
9、次；小兒按體重每日50100mg/kg，分34次靜脈滴注?！?M成人=1000mg/h60kg=16.67mg /(kgh) M兒童=100mg/(kgh)3=33.3mg /(kgh) L=K/M=5EU/(kgh) 33.3mg/(kgh) =0.150EU/mg,27,3、限值（L）的確定,限值計(jì)算時做必要調(diào)整的幾種情況 從嚴(yán)原則 聯(lián)合用藥 特殊情況等,28,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測。 MVD=cL/,29,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,MVD=cL/ L：供試品的細(xì)菌內(nèi)毒
10、素限值 c：供試品溶液的濃度 ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（ EU/ml）,30,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,計(jì)算舉例： a、當(dāng)L以EU/ml表示時，則C等于1.0ml/ml 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng)小于xx EU/ml。 例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，則 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,31,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,計(jì)算舉例： b、當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時，濃度c的單位需為mg/ml或U/ml 。 適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液
11、體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xx EU/mg或EU/U 。,32,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,例：注射用阿莫西林鈉 計(jì)算限值為0.15 EU/mg，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。 需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉 ,在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中,用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。 如稱取100mg注射用阿莫西林鈉 ，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。 MVD=20mg/ml0.15 EU/mg0.125 EU/ml=24倍,33,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，計(jì)算供試品
12、的最小有效稀釋濃度c=/L； 適用于供試品為固體的情況。計(jì)算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。 例：注射用阿莫西林鈉 計(jì)算限值為0.15 EU/mg，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。 最小有效稀釋濃度c= 0.125EU/ml0.15EU/mg=0.833mg/ml,34,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查-凝膠法,2、實(shí)驗(yàn)部分 鱟試劑靈敏度復(fù)核 干擾實(shí)驗(yàn)：預(yù)實(shí)驗(yàn) 正式干擾實(shí)驗(yàn) 檢 查 法：限量試驗(yàn) 半定量試驗(yàn),35,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),目的：不僅是考察鱟試劑靈敏度是否準(zhǔn)確，也是考查檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。 要求每個實(shí)驗(yàn)室在使用一批新的鱟試劑前必須進(jìn)
13、行鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)。,36,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)操作: 取細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。 然后進(jìn)行稀釋，制備成4個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,即2.0、1.0、0.5、0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。,37,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),38,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),放入371的恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘。 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁
14、滑脫者為陰性。 保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。,39,堅(jiān)實(shí)凝膠 陽性“+”,40,未形成凝膠 凝膠不堅(jiān)實(shí) 陰性“”,41,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),結(jié)果判斷： 若最大濃度2管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。 結(jié)果計(jì)算： 反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c）。 c=lg-1（X/4） 式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。 反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。,42,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),+,0.5 ,0.5 ,c= lg-1（(lg +lg +lg0.5 +lg0.5 )/4)=0.707 ,+
15、,+,+,+,+,+,+,+,+,43,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),當(dāng)c在0.52（包括0.5和2）時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。 以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。,44,凝膠法干擾試驗(yàn),目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。 未進(jìn)行過內(nèi)毒素檢查法驗(yàn)證的樣品 當(dāng)供試品的配方和工藝有變化，或供試品陽性對照結(jié)果呈陰性時驗(yàn)證供試品是否存在干擾作用。,45,凝膠法干擾試驗(yàn),試驗(yàn)操作： 在干擾試驗(yàn)中，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液。 解釋：即與所使用的鱟試劑反應(yīng)，不出現(xiàn)陽性的供試品溶液。,
16、46,凝膠法干擾試驗(yàn),試驗(yàn)操作： 預(yù)試驗(yàn) 正式干擾實(shí)驗(yàn),47,凝膠法干擾試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn) 目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/u活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。 優(yōu)點(diǎn)：減少摸索過程、節(jié)省成本,48,凝膠法干擾試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn) 將供試品溶液進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋。 使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。 每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即含2.0濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）。 另做2支陰性對照，和2支陽性對照。,49,凝膠法干擾試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn)結(jié)果判斷 當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實(shí)驗(yàn)為有效。 當(dāng)
17、系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。 即可選擇該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。,50,凝膠法干擾試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn)舉例 供試品限值 硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； 藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U,51,凝膠法干擾試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn)舉例 系列稀釋倍數(shù)的確定 稀釋倍數(shù)一般為MVD0.5MVD0.03，不大于MVD0.03。 MVD0.5 =cL/= 由此可計(jì)算出使用不同時所對應(yīng)的MVD：,52,凝膠法干擾試驗(yàn),如上結(jié)果可初步確定該批硫酸慶大霉素的最小不干 擾稀釋倍數(shù)為80倍，可在
18、此濃度下進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。,53,凝膠法干擾試驗(yàn),正式干擾試驗(yàn) 目的：檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。,54,凝膠法干擾試驗(yàn),正式干擾試驗(yàn) 目的：檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。 通過比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內(nèi)毒素檢查有干擾。,55,凝膠法干擾試驗(yàn),正式干擾試驗(yàn) 操作： 內(nèi)毒素檢查用水 同一支內(nèi)毒素 標(biāo)準(zhǔn)品 供試品溶液 同時制備2支供試品陰性對照和2支陰性對照。,含2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 含2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的供試品溶液,56,凝膠
19、法干擾試驗(yàn) 正式干擾試驗(yàn),結(jié)果判斷： 當(dāng)供試品陰性對照和陰性對照都為陰性 用檢查用水稀釋的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時 試驗(yàn)方為有效,57,凝膠法干擾試驗(yàn) 正式干擾試驗(yàn),分別計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）。 Es=lg-1( Xs/4) Et=lg-1( Xt/4) 當(dāng)Es在0.52（包括0.5和2）及Et在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。,58,凝膠法干擾試驗(yàn) 正式干擾試驗(yàn),試驗(yàn)舉例 硫酸慶大霉素 根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)的結(jié)果
20、，供試品在80倍稀釋時無干擾（對應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml） 選擇將供試品稀釋80倍進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)。 選用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑,59,凝膠法干擾試驗(yàn) 正式干擾試驗(yàn),試驗(yàn)舉例 制備含內(nèi)毒素的供試品80倍稀釋溶液 方法1： 標(biāo)準(zhǔn)品+1ml檢查用水溶解 用硫酸慶大霉素80倍稀釋溶液將內(nèi)毒素稀釋至2.0、0.5、0.25的濃度,60,凝膠法干擾試驗(yàn) 正式干擾試驗(yàn),試驗(yàn)舉例 制備含內(nèi)毒素的供試品80倍稀釋溶液 方法2：標(biāo)準(zhǔn)品+1ml檢查用水溶解 用檢查用水將內(nèi)毒素稀釋至4.0、2.0、0.5 0.5ml 4.0內(nèi)毒素溶液 1ml含2.0內(nèi)毒素的80倍 稀釋溶液 0.5ml 4
21、0倍稀釋溶液,61,62,Es=lg-1( Xs/4) = 0.125 Et=lg-1( Xt/4)=0.177,0.125 0.125 0.25 0.25,0.125 0.125 0.125 0.125,63,凝膠法干擾試驗(yàn),導(dǎo)致干擾的因素： pH值 抗凝因子 螯合劑 葡聚糖 .,64,凝膠法干擾試驗(yàn),排除干擾的方法： 稀釋 中和 過濾 加熱 ,65,凝膠法干擾試驗(yàn),為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 即，先在供試品溶液中添加2濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，然后用所選擇的方法處理溶液，而后再進(jìn)行稀釋、檢測。,66,
22、凝膠法干擾試驗(yàn),由于干擾實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)，因此在干擾實(shí)驗(yàn)中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。 建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實(shí)驗(yàn)造成的陽性影響。,67,凝膠法干擾試驗(yàn),當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 須：三個批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑。 當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 如：內(nèi)毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時,68
23、,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗(yàn),檢驗(yàn)供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限值的定性方法。 每批供試品必須做 2支供試品管 2支供試品陽性對照 同時 每次實(shí)驗(yàn)須做2支陽性對照和2支陰性對照。,69,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗(yàn),例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,供試品溶液： 4倍替硝唑稀釋液 供試品陽性對照為：含0.25EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的4倍替硝唑稀釋液 陽性對照為：濃度為0.25EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液,70,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗(yàn),例：
24、替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+,試驗(yàn)有效,71,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗(yàn),例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+,-,-,此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5 EU/ml， 符合規(guī)定。,72,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗(yàn),例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0
25、.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5 EU/ml， 不符合規(guī)定。,+,+,+,+,+,+,-,-,73,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗(yàn),例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,須復(fù)試。,-,-,-,+,+,+,+,+,74,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗(yàn),復(fù)試時，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均
26、為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。,-,-,+,+,+,+,75,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),半定量試驗(yàn)是使用凝膠法估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法。 系通過確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。,76,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點(diǎn)濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量 。 操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù)下開始進(jìn)行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的MVD。,77,A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗(yàn)的供試品系列稀釋液。 B：供試品陽
27、性對照。（為確證不存在干擾作用） C：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列。（為確證本次試驗(yàn)的操作和環(huán)境都符合要求。） D：陰性對照。,78,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果判斷： 當(dāng)陰性對照溶液D的平行管均為陰 供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性 系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.52之間 試驗(yàn)有效,79,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果計(jì)算：,80,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果計(jì)算：,c=lg-1（X/2）= 0.707，在0.52之間 仍以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度 。,81,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果計(jì)算：,CE=lg-1（X/2）= lg-1（lg4 +lg
28、2 ） /2） = 2.83 ,82,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果計(jì)算： 如果檢驗(yàn)時采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。,83,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果計(jì)算： 例：右旋糖酐20葡萄糖注射液 ，限值為0.5EU/ml 。 通過使用3個鱟試劑廠家的鱟試劑對3個不同廠家的7批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)證實(shí)：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查。 使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進(jìn)行凝膠半定量試驗(yàn)。,84,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),例： 計(jì)算MVD MVD=0.5EU/ml/0.03EU/ml
29、 =16.67倍 從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進(jìn)行1、2、4、8倍的稀釋。（相當(dāng)于又將供試品原液進(jìn)行了4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒有超過MVD。）,85,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),例：,CE=lg-1（X/2）= lg-1（lg4 0.03 +lg2 0.03 ） /2） = 2.83 0.03 =0.0849 EU/ml,86,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),例： 由于檢驗(yàn)時采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù)2倍稀釋液，因此計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)2。 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為： 2 0.0849=0.170 EU
30、/ml,87,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果計(jì)算： 如試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于（如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則記錄為小于乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。,88,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),例：,CE lg-1（X/2）= =0.03 EU/ml 2 0.03= 0.06EU/ml 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：小于0.06EU/ml,89,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),結(jié)果計(jì)算： 如果結(jié)果都為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以。,90,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),例：,CE lg-1（X/2）= 8 =0.24 E
31、U/ml 2 0.24= 0.48EU/ml 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：大于0.48EU/ml,91,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗(yàn),若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。 若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。,92,注意事項(xiàng),實(shí)驗(yàn)前，須用肥皂洗手，用75酒精棉球消毒。 在使用洗耳球、移液管取樣時，應(yīng)注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內(nèi)毒素進(jìn)入供試液。 溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時，不要劇烈振蕩避免產(chǎn)生氣泡。 由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過程中及觀察結(jié)果時應(yīng)注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。,93,注意事項(xiàng),進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)時，標(biāo)準(zhǔn)對照系列和含內(nèi)毒素的供試品溶液系列應(yīng)同時進(jìn)行。 在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，各個實(shí)驗(yàn)中要求的對照應(yīng)同時進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)有效的情況才能進(jìn)行計(jì)算和判斷。 實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在清潔環(huán)境中進(jìn)行，過程中應(yīng)防止微生物的污染。,94,謝謝！ 2008年12月,
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講稿課件
