第五六章 愈傷組織培養(yǎng)

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1、第五章 愈傷組織的培養(yǎng)n第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化愈傷組織的誘導(dǎo)和分化n第二節(jié)第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生n第三節(jié)第三節(jié) 人工種子人工種子第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化愈傷組織的誘導(dǎo)和分化n1 愈傷組織概念愈傷組織概念n2 愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)n3 影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素1 愈傷組織概念愈傷組織概念 植物各種器官的外植體在離體的條件下，經(jīng)細(xì)胞脫分化等一系列過(guò)程改變了它們?cè)械奶匦远纬傻囊环N能迅速增殖的無(wú)特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團(tuán)，稱為愈傷組織(callus)。 2 愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)2.1 來(lái)源：依外植體不同

2、，愈傷組織可以發(fā)生自形成層、皮層、髓、次生韌皮部及木薄壁組織和表皮等。n誘導(dǎo)愈傷組織成敗的關(guān)鍵在于培養(yǎng)的條件。2.2 培養(yǎng)的條件培養(yǎng)的條件-植物激素的作用植物激素的作用n生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素2,4-D、IAA和和NAA，0.0110mgL-1，n細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素6-BA，0.110mgL-1。n生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)保持愈傷組織的快速生長(zhǎng)是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)保持愈傷組織的快速生長(zhǎng)是必要的必要的，特別是兩者結(jié)合應(yīng)用時(shí)，能更強(qiáng)烈地刺激，特別是兩者結(jié)合應(yīng)用時(shí)，能更強(qiáng)烈地刺激愈傷組織的形成。愈傷組織的形成。誘導(dǎo)植物器官形成愈傷組織的培養(yǎng)基誘導(dǎo)植物器官形成愈傷組織的培養(yǎng)基 2.3 愈傷組織的形成愈傷組織的形

3、成n從外植體脫分化形從外植體脫分化形成成典型的典型的愈傷組織愈傷組織大致可分為三個(gè)時(shí)大致可分為三個(gè)時(shí)期：期：愈傷組織形成愈傷組織形成起始期起始期分裂期分裂期形成期形成期2.3.1 起始期：起始期：n細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。n外植體的細(xì)胞處在外植體的細(xì)胞處在靜止?fàn)顟B(tài)靜止?fàn)顟B(tài)。n一些一些刺激因素刺激因素(如機(jī)械損傷、改變光照強(qiáng)度、增加氧如機(jī)械損傷、改變光照強(qiáng)度、增加氧等等)和激素的誘導(dǎo)和激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成, 誘導(dǎo)細(xì)胞開(kāi)始分裂誘導(dǎo)細(xì)胞開(kāi)始分裂。起始期細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的變化起始期細(xì)

4、胞內(nèi)發(fā)生的變化氣體交換增加，如氧氣的吸收增加氣體交換增加，如氧氣的吸收增加激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成活動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成, 誘導(dǎo)細(xì)胞開(kāi)誘導(dǎo)細(xì)胞開(kāi)始分裂。始分裂。RNA含量增加含量增加 蛋白質(zhì)量增加（每個(gè)細(xì)胞的總增加量為蛋白質(zhì)量增加（每個(gè)細(xì)胞的總增加量為200%）酶活性增強(qiáng)酶活性增強(qiáng)細(xì)胞的大小仍然和外植體時(shí)一樣，細(xì)胞的大小仍然和外植體時(shí)一樣，沒(méi)有多大沒(méi)有多大改變改變 起始期的長(zhǎng)短：起始期的長(zhǎng)短：p由一系列由一系列內(nèi)部?jī)?nèi)部（植物的種類(lèi)、生理狀況）和（植物的種類(lèi)、生理狀況）和外部外部（光照、外源激素）因素決定。（光

5、照、外源激素）因素決定。p例如菊芋的起始期有時(shí)還不需要例如菊芋的起始期有時(shí)還不需要1 1天，胡蘿卜則要天，胡蘿卜則要好幾天，好幾天，p而菊芋塊莖貯藏時(shí)間的改變，起始期也發(fā)生改變。而菊芋塊莖貯藏時(shí)間的改變，起始期也發(fā)生改變。2.3.2 分裂期分裂期:分裂期：分裂期：外植體細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)以后外植體細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)以后脫分化脫分化，不斷，不斷分分裂增生裂增生子細(xì)胞的過(guò)程。子細(xì)胞的過(guò)程。脫分化：脫分化：細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期，恢復(fù)分裂機(jī)能，細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期，恢復(fù)分裂機(jī)能，分裂期外植體的特征分裂期外植體的特征:細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分

6、化的狀態(tài)，顏色淺其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。而透明。外層細(xì)胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使外層細(xì)胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外層細(xì)胞數(shù)目增加，得外層細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞的核和核仁增大到最大。細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞的核和核仁增大到最大。逐步回到逐步回到分生組織狀態(tài)。分生組織狀態(tài)。細(xì)胞中細(xì)胞中RNA含量達(dá)到最大值。含量達(dá)到最大值。隨著細(xì)胞不斷分裂和生長(zhǎng)，細(xì)胞總干重、蛋隨著細(xì)胞不斷分裂和生長(zhǎng)，細(xì)胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快。分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn)分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn):2.3.3 形成期：形成期：n形成期是指在分裂期的末期，

7、細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)形成期是指在分裂期的末期，細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細(xì)胞。內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細(xì)胞。n細(xì)胞類(lèi)型包括：薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)細(xì)胞類(lèi)型包括：薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞、纖維細(xì)胞，等等。胞、纖維細(xì)胞，等等。 細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：內(nèi)部細(xì)胞發(fā)生分內(nèi)部細(xì)胞發(fā)生分裂，形成像維管束或類(lèi)似分生組織組成的鳥(niǎo)巢狀裂，形成像維管束或類(lèi)似分生組織組成的鳥(niǎo)巢狀結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定。細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定。出現(xiàn)了各種類(lèi)型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄出現(xiàn)了各種類(lèi)型的細(xì)胞：如

8、管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。形成期細(xì)胞特點(diǎn)：形成期細(xì)胞特點(diǎn)：愈傷組織的分類(lèi)愈傷組織的分類(lèi) 易碎的愈傷易碎的愈傷 堅(jiān)硬的愈傷堅(jiān)硬的愈傷 生根的愈傷生根的愈傷 滲出粘性多糖的愈傷滲出粘性多糖的愈傷 根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為： Redwhite callusGreen callusYellow callus根據(jù)愈傷色澤劃分為：根據(jù)愈傷色澤劃分為：根據(jù)愈傷發(fā)生部位：根據(jù)愈傷發(fā)生部位：愈傷組織生長(zhǎng)周期愈傷組

9、織生長(zhǎng)周期n愈傷組織生長(zhǎng)周期為愈傷組織生長(zhǎng)周期為24周周。n愈傷組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，由于營(yíng)養(yǎng)物愈傷組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，質(zhì)枯竭，水分散失，或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長(zhǎng)，甚至老化變黑、死亡。織停止生長(zhǎng)，甚至老化變黑、死亡。n必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng), n如果要讓愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)增殖，必須定期地如果要讓愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)增殖，必須定期地(如如24周周)將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織就可以長(zhǎng)期保持旺盛的生長(zhǎng)。就可以

10、長(zhǎng)期保持旺盛的生長(zhǎng)。第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化愈傷組織的誘導(dǎo)和分化n1 愈傷組織概念愈傷組織概念n2 愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)n3 影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素（1）不同植物和外植體誘導(dǎo)愈傷組織能力的差異。）不同植物和外植體誘導(dǎo)愈傷組織能力的差異。不同植物種類(lèi)、同一植物不同器官來(lái)源及其生理狀況、不同植物種類(lèi)、同一植物不同器官來(lái)源及其生理狀況、年齡的外植體的脫分化（形成愈傷組織）能力有很大年齡的外植體的脫分化（形成愈傷組織）能力有很大差別。差別。n例如，煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本例如，煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化

11、比較難；科植物的脫分化比較難；n花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；n幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。較難。3 影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素（2）培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。）培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。選擇適當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)幕九囵B(yǎng)基對(duì)愈傷的生長(zhǎng)很重要。誘導(dǎo)愈傷的基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷的生長(zhǎng)很重要。誘導(dǎo)愈傷組織常用的培養(yǎng)基為組織常用的培養(yǎng)基為MS和和B5。（3）外源激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響）外源激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響-重要因素。重要因素。（4）培養(yǎng)

12、條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響）培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響: 濕度條件、濕度條件、溫度條件、光照條件。溫度條件、光照條件。 2,4-D和和BA濃度對(duì)銀膠菊莖段愈傷組織生長(zhǎng)的影響濃度對(duì)銀膠菊莖段愈傷組織生長(zhǎng)的影響處理（處理（2,4-D:BA）愈傷組織形成情況愈傷組織形成情況0: 0僅有，不生長(zhǎng)僅有，不生長(zhǎng)0: 0.1有限的生長(zhǎng)，顯綠色有限的生長(zhǎng)，顯綠色0：0.2生長(zhǎng)不良生長(zhǎng)不良0.05: 0大塊、綠色，平均直徑為大塊、綠色，平均直徑為10mm0.05: 1生長(zhǎng)不良，稍帶褐色生長(zhǎng)不良，稍帶褐色0.05: 2生長(zhǎng)不良，稍帶褐色生長(zhǎng)不良，稍帶褐色0.1: 0大塊，綠色至淺褐色大塊，綠色至淺褐色0.1: 0

13、.1大塊，綠色至淺褐色大塊，綠色至淺褐色0.1: 0.2稍小于稍小于0.1:0.1比例，變褐比例，變褐 各種生長(zhǎng)素對(duì)黃瓜各外植體愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)各種生長(zhǎng)素對(duì)黃瓜各外植體愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)（各種生長(zhǎng)素濃度為（各種生長(zhǎng)素濃度為10mol/L）生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素愈傷組織形成愈傷組織形成種子種子下胚軸下胚軸果皮果皮IBA無(wú)愈傷組織形成無(wú)愈傷組織形成愈傷組織增殖強(qiáng)愈傷組織增殖強(qiáng)IBA濃度為濃度為1mol/L時(shí)愈時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)良好傷組織生長(zhǎng)良好NAA無(wú)愈傷組織形成無(wú)愈傷組織形成所有外植體均產(chǎn)生所有外植體均產(chǎn)生愈傷組織愈傷組織愈傷組織增殖強(qiáng)愈傷組織增殖強(qiáng)2,4-D所有外植體均產(chǎn)所有外植體均產(chǎn)生愈傷組織生愈傷組織

14、2,4-D濃度為濃度為1mol/L時(shí)時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)良好愈傷組織生長(zhǎng)良好愈傷組織增殖強(qiáng)愈傷組織增殖強(qiáng)NOA萘氧乙酸萘氧乙酸無(wú)愈傷組織形成無(wú)愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖中等NOP萘氧丙酸萘氧丙酸無(wú)愈傷組織形成無(wú)愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖強(qiáng)織增殖強(qiáng)愈傷組織增殖強(qiáng)愈傷組織增殖強(qiáng) 優(yōu)良愈傷組織具備的特性優(yōu)良愈傷組織具備的特性n1）高度的胚性，易于得到再生植株）高度的胚性，易于得到再生植株n2）分散性好，易于建立優(yōu)良懸浮系）分散性好，易于建立優(yōu)良懸浮系n3）增殖能力旺盛）增殖能力旺盛n4）經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)不喪失胚性。）經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期

15、繼代培養(yǎng)不喪失胚性。第五章 愈傷組織的培養(yǎng)n第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化愈傷組織的誘導(dǎo)和分化n第二節(jié)第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生n第三節(jié)第三節(jié) 人工種子人工種子第二節(jié)第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生n經(jīng)過(guò)起動(dòng)、分裂和形成期產(chǎn)生的愈傷組織，其中雖然發(fā)生了細(xì)胞分化，但是并沒(méi)有器官發(fā)生。n只有滿足某些條件，愈傷組織的細(xì)胞才會(huì)發(fā)生再分化，產(chǎn)生芽和根，進(jìn)而發(fā)育成完整植株。n1 愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式n2 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成不定芽或不定根形成不定芽或不定根n3 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成胚狀體形成胚狀體n4 愈傷組

16、織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用1 愈傷組織形態(tài)愈傷組織形態(tài) 發(fā)生方式發(fā)生方式在愈傷組織的不同部位分別形成在愈傷組織的不同部位分別形成根和芽根和芽 先不定芽，在莖基部長(zhǎng)根先不定芽，在莖基部長(zhǎng)根先長(zhǎng)根，后長(zhǎng)芽先長(zhǎng)根，后長(zhǎng)芽通過(guò)通過(guò)體細(xì)胞胚胎體細(xì)胞胚胎/胚胚狀體狀體途徑再生植株途徑再生植株無(wú)根苗無(wú)根苗形成有根苗形成有根苗n1 愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式n2 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成不定芽或不定根形成不定芽或不定根n3 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成胚狀體形成胚狀體n4 愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用2 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成不定芽或不定根形成

17、不定芽或不定根2.1 植物激素的作用n適宜的植物激素配比在器官分化中有著重要的作用。n激素配比模式激素配比模式n生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。是愈傷組織、長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。2.2 外植體自身因素 高：有利于根的形成和愈傷組織的形成；高：有利于根的形成和愈傷組織的形成； 適中：有利于根芽的分化；適中：有利于根芽的分化； 低：有利于芽的形成低：有利于芽的形成生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素愈傷分化愈傷分化生長(zhǎng)素在愈傷組織形態(tài)建成中的作用極為重生長(zhǎng)素在愈傷組織形態(tài)建成中的作用極為重要，對(duì)形成維管組織分化過(guò)程有顯著影響要，對(duì)形

18、成維管組織分化過(guò)程有顯著影響nWetmore等用洋丁香芽嫁接于愈傷組織上，在芽基部的等用洋丁香芽嫁接于愈傷組織上，在芽基部的周?chē)l(fā)生了零星分布的分裂細(xì)胞團(tuán)，稍后由進(jìn)一步分化成周?chē)l(fā)生了零星分布的分裂細(xì)胞團(tuán)，稍后由進(jìn)一步分化成維管組織。維管組織。 圖圖 在丁香的愈傷組織上嫁接一個(gè)具在丁香的愈傷組織上嫁接一個(gè)具2個(gè)或個(gè)或3個(gè)葉原基的莖端個(gè)葉原基的莖端 嫁接后嫁接后54天愈傷組織中維管組織的誘導(dǎo)情況天愈傷組織中維管組織的誘導(dǎo)情況 1苗端苗端 2維管束維管束 3愈傷組織塊愈傷組織塊n法國(guó)植物學(xué)家法國(guó)植物學(xué)家Camus（1949）將小營(yíng)養(yǎng)芽嫁接在）將小營(yíng)養(yǎng)芽嫁接在菊苣屬植物根的愈傷組織表面，經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)

19、間菊苣屬植物根的愈傷組織表面，經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，愈傷組織已分化出維管組織。后，愈傷組織已分化出維管組織。n證實(shí)：證實(shí)：芽能誘導(dǎo)維管組織的分化是與芽在生長(zhǎng)芽能誘導(dǎo)維管組織的分化是與芽在生長(zhǎng)時(shí)合成了某些植物激素有關(guān)時(shí)合成了某些植物激素有關(guān)。n生長(zhǎng)素濃度和木質(zhì)部發(fā)生之間存在著一種反比生長(zhǎng)素濃度和木質(zhì)部發(fā)生之間存在著一種反比關(guān)系，關(guān)系，低濃度的生長(zhǎng)素能刺激木質(zhì)部的發(fā)生低濃度的生長(zhǎng)素能刺激木質(zhì)部的發(fā)生。通常不定芽和根的形成分兩步：通常不定芽和根的形成分兩步：n1）誘導(dǎo)不定芽：）誘導(dǎo)不定芽：采用分化培養(yǎng)基（含有采用分化培養(yǎng)基（含有6-BA、KT等）使得愈傷組織形成不定芽，增加繁殖等）使得愈傷組織形成不定芽

20、，增加繁殖系數(shù)。系數(shù)。n2）誘導(dǎo)根：）誘導(dǎo)根：不定芽長(zhǎng)大出現(xiàn)葉片后，將伸長(zhǎng)不定芽長(zhǎng)大出現(xiàn)葉片后，將伸長(zhǎng)的苗從基部切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（含生長(zhǎng)素的苗從基部切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（含生長(zhǎng)素IBA 、NAA）誘導(dǎo)生根。）誘導(dǎo)生根。 n采用采用12MS培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基，降低無(wú)，降低無(wú)機(jī)鹽濃度有利于根的分化。機(jī)鹽濃度有利于根的分化。蘆薈的植物組織培養(yǎng)過(guò)程蘆薈的植物組織培養(yǎng)過(guò)程1 2 3 4 56 7 8 910 11芽（單芽、叢芽）芽（單芽、叢芽）2 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成不定芽或不定根形成不定芽或不定根2.1 植物激素的作用植物激素的作用2.2 外植體自身因素外植體自

21、身因素2.2 外植體自身因素n在栽培或插條中容易再生的植物，其器官或組在栽培或插條中容易再生的植物，其器官或組織在離體培養(yǎng)下也容易再生?？椩陔x體培養(yǎng)下也容易再生。n通常在培養(yǎng)中先形成不定芽者，其基部多易生通常在培養(yǎng)中先形成不定芽者，其基部多易生根；根；n但有些植株完成再生苗后，生根仍較困難。但有些植株完成再生苗后，生根仍較困難。n愈傷組織的器官分化與分生細(xì)胞團(tuán)有密切關(guān)系愈傷組織的器官分化與分生細(xì)胞團(tuán)有密切關(guān)系。n一般從莖尖或胚誘導(dǎo)的愈傷組織容易分化形成一般從莖尖或胚誘導(dǎo)的愈傷組織容易分化形成器官，這可能與這些愈傷組織有頂端分生組織器官，這可能與這些愈傷組織有頂端分生組織的分生細(xì)胞團(tuán)有關(guān)，的分生

22、細(xì)胞團(tuán)有關(guān)，n經(jīng)脫分化誘導(dǎo)的愈傷組織如果很少或較難形成經(jīng)脫分化誘導(dǎo)的愈傷組織如果很少或較難形成分生細(xì)胞團(tuán)，其發(fā)生器官或組織分化的難度就分生細(xì)胞團(tuán)，其發(fā)生器官或組織分化的難度就大。大。n1 愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式n2 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成不定芽或不定根形成不定芽或不定根n3 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成胚狀體形成胚狀體n4 愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用3 愈傷組織形態(tài)發(fā)生-形成體細(xì)胞胚胎n胚狀體的概念胚狀體的概念n胚狀體在發(fā)育早期的特征胚狀體在發(fā)育早期的特征n產(chǎn)生方式產(chǎn)生方式n胚狀體誘導(dǎo)的影響因素胚狀體誘導(dǎo)的影響因素n胚狀體再生植株胚狀體再生

23、植株n誘導(dǎo)胚狀體途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn)誘導(dǎo)胚狀體途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn)3.1 胚狀體/體細(xì)胞胚（embryoid） ：指植物細(xì)胞、組織或器官的離體培養(yǎng)中，起始于一個(gè)非合子細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)育過(guò)程分化出的類(lèi)似胚一樣的細(xì)胞群。n經(jīng)過(guò)：球形胚心形胚魚(yú)雷形胚成熟胚可可心形胚和球形胚香蕉心形體細(xì)胞胚 玫瑰心形體細(xì)胞胚 胚狀體從愈傷組織外層細(xì)胞以及深部細(xì)胞起源至少發(fā)現(xiàn)至少發(fā)現(xiàn)43科，科，93屬，屬，117種植物能形成胚狀體。種植物能形成胚狀體。植物體細(xì)胞具有成胚的潛力植物體細(xì)胞具有成胚的潛力圖圖5-5 石龍芮胚狀體發(fā)生的過(guò)程石龍芮胚狀體發(fā)生的過(guò)程12. 實(shí)生苗的下胚軸表面出現(xiàn)的胚狀體實(shí)生苗的下胚軸表面出現(xiàn)的胚狀體

24、 3. 下胚軸的部分放大下胚軸的部分放大4. 表皮細(xì)胞的最初啟動(dòng)表皮細(xì)胞的最初啟動(dòng) 58. 產(chǎn)生胚狀體的表面細(xì)胞啟動(dòng)情況產(chǎn)生胚狀體的表面細(xì)胞啟動(dòng)情況9. 球形狀球形狀 10. 早期的心形胚早期的心形胚 1112. 已產(chǎn)生子葉和苗端的胚已產(chǎn)生子葉和苗端的胚13.下胚軸橫切面示不同發(fā)育情況的胚狀體下胚軸橫切面示不同發(fā)育情況的胚狀體注意：體細(xì)胞胚不同于合子胚不同于合子胚不同于孤雌不同于孤雌/雄胚雄胚不同于器官發(fā)生方式形成的幼苗不同于器官發(fā)生方式形成的幼苗3.2 體細(xì)胞胚狀體在發(fā)育早期的特征a、具有兩極性，、具有兩極性，即有莖端和根端即有莖端和根端。b、胚狀體的維管組織與外植體的維管、胚狀體的維管組織

25、與外植體的維管組織無(wú)解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或組織無(wú)解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。相聯(lián)系。c、胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的、胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“Y”形，而不定芽的維管組織無(wú)此現(xiàn)形，而不定芽的維管組織無(wú)此現(xiàn)象。象。其發(fā)生有三個(gè)特征維管系統(tǒng)非獨(dú)立的維管系統(tǒng) 3.3 胚狀體的產(chǎn)生方式胚狀體的產(chǎn)生方式n1）直接在器官上發(fā)生）直接在器官上發(fā)生n2）培養(yǎng)物先形成愈傷組織，再由愈傷組織分）培養(yǎng)物先形成愈傷組織，再由愈傷組織分化成胚狀體化成胚狀體n3）花藥培養(yǎng)中，由小孢子發(fā)育成）花藥培養(yǎng)中，由小孢子發(fā)育成n4）在單細(xì)胞和

26、原生質(zhì)體培養(yǎng)中，由細(xì)胞先形）在單細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)中，由細(xì)胞先形成一個(gè)胚形細(xì)胞團(tuán)，再發(fā)育成胚狀體。成一個(gè)胚形細(xì)胞團(tuán)，再發(fā)育成胚狀體。1）生長(zhǎng)素）生長(zhǎng)素2）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用3）氨源形態(tài)的影響）氨源形態(tài)的影響4）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響3.4 體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)的影響因素3.4 體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)的影響因素1）生長(zhǎng)素）生長(zhǎng)素n愈傷組織在愈傷組織在生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素0.51mg/L的培養(yǎng)的培養(yǎng)基上分化形成分生細(xì)胞團(tuán)（稱胚性細(xì)基上分化形成分生細(xì)胞團(tuán)（稱胚性細(xì)胞團(tuán)）；胞團(tuán)）；n轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)素含量很低（轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)素含量很低（0.010.1mg/L）或

27、完全沒(méi)有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)）或完全沒(méi)有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，就能發(fā)育為成熟胚。基上，就能發(fā)育為成熟胚。n形成體細(xì)胞胚的關(guān)鍵形成體細(xì)胞胚的關(guān)鍵是是除去或降低培除去或降低培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素成分養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素成分（如（如2,4-D）。）。n原因：原因：2,4-D等生長(zhǎng)素可以誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯（等生長(zhǎng)素可以誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯（Eth）產(chǎn)生；內(nèi)源產(chǎn)生；內(nèi)源Eth不影響愈傷增殖，但抑制愈傷不影響愈傷增殖，但抑制愈傷組織進(jìn)一步分化成胚。組織進(jìn)一步分化成胚。n乙烯含量的增加將導(dǎo)致纖維素酶或（和）果膠乙烯含量的增加將導(dǎo)致纖維素酶或（和）果膠酶活性的增強(qiáng)，在原胚發(fā)生極性分化之前破壞酶活性的增強(qiáng)，在原胚發(fā)生極性分化之前破壞胚性細(xì)胞團(tuán)，使原

28、胚不能發(fā)生組織分化。胚性細(xì)胞團(tuán)，使原胚不能發(fā)生組織分化。2）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用細(xì)胞分裂素有利于胚狀體的形成細(xì)胞分裂素有利于胚狀體的形成n在葡萄珠心培養(yǎng)中，當(dāng)培養(yǎng)基里存在在葡萄珠心培養(yǎng)中，當(dāng)培養(yǎng)基里存在-萘氧乙萘氧乙酸和酸和BAP時(shí)，能形成體細(xì)胞胚。時(shí)，能形成體細(xì)胞胚。n0.1gL-1 玉米素玉米素促進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生。促進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生。nGA3、ABA抑制成胚；抑制成胚；1）生長(zhǎng)素）生長(zhǎng)素2）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用3）氨源形態(tài)的影響）氨源形態(tài)的影響4）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響3.4 體細(xì)胞胚狀體誘

29、導(dǎo)的影響因素3）氨源形態(tài)的影響）氨源形態(tài)的影響n還原還原N（NH4+）n氧化氧化N（NO3-） n有機(jī)氮有機(jī)氮 （氨基酸、水解酪蛋白等）（氨基酸、水解酪蛋白等）n野生胡蘿卜葉柄節(jié)段的培養(yǎng)中，只有在含一定野生胡蘿卜葉柄節(jié)段的培養(yǎng)中，只有在含一定數(shù)量數(shù)量還原態(tài)氮還原態(tài)氮的培養(yǎng)基時(shí)，才能有胚胎發(fā)生，的培養(yǎng)基時(shí)，才能有胚胎發(fā)生，n用用NH4+ 和水解酪蛋白優(yōu)于和水解酪蛋白優(yōu)于NO3- 或谷氨酰胺。或谷氨酰胺。4）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響n液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)n適宜適宜pH5-6n光照：不需要光或半天光照時(shí)間光照：不需要光或半天光照時(shí)間n溫度溫度25 左右。左右。光照強(qiáng)

30、度光照強(qiáng)度50-60 E m2 s-1光照強(qiáng)度光照強(qiáng)度5-10 E m2 s-1( (圖圖 光對(duì)大豆不同品種子葉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響光對(duì)大豆不同品種子葉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響 ) )3 愈傷組織形態(tài)發(fā)生-形成體細(xì)胞胚胎n胚狀體的概念胚狀體的概念n胚狀體在發(fā)育早期的特征胚狀體在發(fā)育早期的特征n產(chǎn)生方式產(chǎn)生方式n胚狀體誘導(dǎo)的影響因素胚狀體誘導(dǎo)的影響因素n胚狀體再生植株胚狀體再生植株n誘導(dǎo)胚狀體途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn)誘導(dǎo)胚狀體途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn)3.5 胚狀體再生植株n體細(xì)胞胚常常能在原來(lái)的培養(yǎng)基上成熟和萌發(fā)。體細(xì)胞胚常常能在原來(lái)的培養(yǎng)基上成熟和萌發(fā)。n對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)冷處理的幼齡或成熟的胚必須先經(jīng)對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)冷處理的

31、幼齡或成熟的胚必須先經(jīng)歷一段低溫處理之后，才能正常地長(zhǎng)成小植株。歷一段低溫處理之后，才能正常地長(zhǎng)成小植株。n在柑橘屬植物體細(xì)胞胚萌發(fā)期間，需要在柑橘屬植物體細(xì)胞胚萌發(fā)期間，需要GA3促促進(jìn)根和莖的發(fā)育。進(jìn)根和莖的發(fā)育。3.6 誘導(dǎo)胚狀體途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn)誘導(dǎo)胚狀體途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn)n1）數(shù)量）數(shù)量比不定芽多比不定芽多n2）獲得速度快）獲得速度快n3）結(jié)構(gòu)完整）結(jié)構(gòu)完整n4）胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存；）胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存；n5）胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。）胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。 胚狀體與合子胚的比較胚狀體與合子胚的比較合子胚胚狀體質(zhì)量萌發(fā)

32、率高，質(zhì)量好 萌發(fā)率低，質(zhì)量差來(lái)源受精卵體細(xì)胞胚柄有，明顯即使有也不明顯形態(tài)固定，體積相對(duì)較小復(fù)雜，常有兩個(gè)以上的子葉，體積相對(duì)較大變異率低高n1 愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式n2 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成不定芽或不定根形成不定芽或不定根n3 愈傷組織器官發(fā)生愈傷組織器官發(fā)生-形成胚狀體形成胚狀體n4 愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用 4 愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用 a、加快園藝植物新品種和良種繁育速度、加快園藝植物新品種和良種繁育速度b、培養(yǎng)無(wú)病毒苗木、培養(yǎng)無(wú)病毒苗木c、獲得倍性不同的植物、獲得倍性不同的植物d、克服遠(yuǎn)緣雜交困難、克服遠(yuǎn)緣雜交困難e、利

33、于種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸、利于種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸f、提供育種中間材料、提供育種中間材料g、誘發(fā)和離體篩選突變體、誘發(fā)和離體篩選突變體h、制造人工種子、制造人工種子第五章 愈傷組織的培養(yǎng)n第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化愈傷組織的誘導(dǎo)和分化n第二節(jié)第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生n第三節(jié)第三節(jié) 人工種子人工種子n人工種子是指外面包裹一層有機(jī)薄膜的植物胚狀體。人工種子是指外面包裹一層有機(jī)薄膜的植物胚狀體。n組成：組成：n胚狀體或芽胚狀體或芽：有生命的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。：有生命的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。n人工胚乳：人工胚乳：供供胚狀體維持生命力。胚狀體維持生命力。n人工種皮人工種皮：保護(hù)

34、作用。：保護(hù)作用。1 定義與結(jié)構(gòu)定義與結(jié)構(gòu) 第三節(jié)第三節(jié) 人工種子人工種子(1) 人工種子的胚人工種子的胚主要是指體細(xì)胞胚，此外還有頂芽、腋芽、小鱗莖等也可主要是指體細(xì)胞胚，此外還有頂芽、腋芽、小鱗莖等也可以做為人工種子的胚。以做為人工種子的胚。 （2）人工種皮）人工種皮 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 對(duì)胚狀體或芽無(wú)毒害對(duì)胚狀體或芽無(wú)毒害 柔軟且有一定機(jī)械抗壓能力柔軟且有一定機(jī)械抗壓能力 能保持一定水分及營(yíng)養(yǎng)物能保持一定水分及營(yíng)養(yǎng)物 允許種皮內(nèi)外氣體交換通暢允許種皮內(nèi)外氣體交換通暢 不影響胚萌發(fā)突破不影響胚萌發(fā)突破 播種后易于化解播種后易于化解 目前人工種皮常選用的材料有藻酸鹽等水目前人工種皮常選用的材料有藻

35、酸鹽等水凝膠、瓊脂糖、角叉膠等。凝膠、瓊脂糖、角叉膠等。（3）人工胚乳）人工胚乳 胚乳是胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)條件，因此胚乳是胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)條件，因此人工胚乳的基本成分仍是胚發(fā)育所需各人工胚乳的基本成分仍是胚發(fā)育所需各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分，此外，還可根據(jù)需要添加類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分，此外，還可根據(jù)需要添加激素、抗生素、農(nóng)藥等成分，以提高人激素、抗生素、農(nóng)藥等成分，以提高人工種子的抗性與品質(zhì)。工種子的抗性與品質(zhì)。1）人工種子結(jié)構(gòu)完整，體積小，便于貯藏與運(yùn)）人工種子結(jié)構(gòu)完整，體積小，便于貯藏與運(yùn)輸，可直接播種，易于機(jī)械化操作；輸，可直接播種，易于機(jī)械化操作；2）不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制約，胚狀體數(shù)量）不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制

36、約，胚狀體數(shù)量多、繁殖快、有利于工廠化生產(chǎn)；多、繁殖快、有利于工廠化生產(chǎn)；2 人工種子的優(yōu)點(diǎn)人工種子的優(yōu)點(diǎn)3) 有利于繁殖生育周期長(zhǎng)、自交不親合、珍貴稀有利于繁殖生育周期長(zhǎng)、自交不親合、珍貴稀有的一些植物，也可大量繁殖無(wú)病毒材料；有的一些植物，也可大量繁殖無(wú)病毒材料；4) 可在人工種子中加入抗生素、農(nóng)藥、菌肥等成可在人工種子中加入抗生素、農(nóng)藥、菌肥等成分，提高種子活力和品質(zhì)；分，提高種子活力和品質(zhì)；5) 由無(wú)性繁殖體系產(chǎn)生胚，可以固定雜種優(yōu)勢(shì)。由無(wú)性繁殖體系產(chǎn)生胚，可以固定雜種優(yōu)勢(shì)。 3 制作制作人工種子制作過(guò)程人工種子制作過(guò)程胚狀體胚狀體人工胚乳人工胚乳其他物質(zhì)其他物質(zhì)人工種皮人工種皮包埋包

37、埋技術(shù)技術(shù)第一步胚狀體誘導(dǎo)n1）選取目標(biāo)植物）選取目標(biāo)植物n2）誘導(dǎo)愈傷組織）誘導(dǎo)愈傷組織n3）愈傷組織增生）愈傷組織增生n4）胚狀體誘導(dǎo)）胚狀體誘導(dǎo)胚狀體胚狀體同步增殖同步增殖：nDNA合成抑制劑合成抑制劑n低溫處理低溫處理n調(diào)節(jié)滲透壓調(diào)節(jié)滲透壓n分離過(guò)篩分離過(guò)篩n調(diào)節(jié)植物激素配比。調(diào)節(jié)植物激素配比?？刂婆咝约?xì)胞同步分裂控制胚性細(xì)胞同步分裂（1）細(xì)胞培養(yǎng)初期加入細(xì)胞培養(yǎng)初期加入DNA合成抑制劑合成抑制劑如五氨基如五氨基腺嘧啶，使細(xì)胞腺嘧啶，使細(xì)胞DNA合成暫時(shí)停止。一旦除去合成暫時(shí)停止。一旦除去DNA抑制劑，細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入同步分裂。抑制劑，細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入同步分裂。（2 2）低溫處理抑制細(xì)胞分裂，

38、）低溫處理抑制細(xì)胞分裂，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后再經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后再把溫度提高到正常培養(yǎng)溫度，也能使胚性細(xì)胞把溫度提高到正常培養(yǎng)溫度，也能使胚性細(xì)胞達(dá)到同步分裂的目的。達(dá)到同步分裂的目的。（3 3）調(diào)節(jié)滲透壓控制胚性細(xì)胞的同步發(fā)育，）調(diào)節(jié)滲透壓控制胚性細(xì)胞的同步發(fā)育，不同不同發(fā)育階段的胚，具有不同的滲透壓要求。發(fā)育階段的胚，具有不同的滲透壓要求。n如向日葵胚發(fā)育不同階段對(duì)糖濃度要求不同，如向日葵胚發(fā)育不同階段對(duì)糖濃度要求不同，球胚期球胚期17.517.5，心形期胚，心形期胚12.512.5，魚(yú)雷胚期，魚(yú)雷胚期8.58.5，成熟胚期，成熟胚期0.50.5。 （4）分離過(guò)篩，）分離過(guò)篩，用不同孔徑的尼龍網(wǎng)過(guò)濾

39、，用不同孔徑的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，來(lái)選擇不同發(fā)育階段的胚。來(lái)選擇不同發(fā)育階段的胚。n 或者采用或者采用密度梯度離心法密度梯度離心法來(lái)選擇不同發(fā)育來(lái)選擇不同發(fā)育階段的胚。階段的胚。 （5）通氣調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，乙烯的產(chǎn)生與細(xì)）通氣調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，乙烯的產(chǎn)生與細(xì)胞分裂有著密切關(guān)系。胞分裂有著密切關(guān)系。n在細(xì)胞分裂達(dá)到高峰前，有一個(gè)乙烯合成在細(xì)胞分裂達(dá)到高峰前，有一個(gè)乙烯合成高峰。在培養(yǎng)基中通入乙烯或氮?dú)猓扛叻?。在培養(yǎng)基中通入乙烯或氮?dú)猓?0h或或20h通通1次，每次通次，每次通3-4s，可將細(xì)胞的有絲，可將細(xì)胞的有絲分裂提高到分裂提高到12-16。第二步人工胚乳制作人工胚乳的成分人工胚乳的成分n 無(wú)機(jī)鹽混合

40、物。無(wú)機(jī)鹽混合物。n 碳水化合物：淀粉和糖。碳水化合物：淀粉和糖。n 蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。n 各種附加成分，如固氮細(xì)菌、殺蟲(chóng)劑、殺菌各種附加成分，如固氮細(xì)菌、殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、除草劑和植物激素等。劑、除草劑和植物激素等。第三步人工種皮制作1）包埋介質(zhì)的選擇：）包埋介質(zhì)的選擇：n無(wú)毒、透氣、保水性好無(wú)毒、透氣、保水性好n有足夠硬度（不脹大），保證安全（不泄露營(yíng)有足夠硬度（不脹大），保證安全（不泄露營(yíng)養(yǎng)物）養(yǎng)物）n包埋材料：包埋材料：n瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、淀粉、動(dòng)物膠、瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、淀粉、動(dòng)物膠、角叉膠、刺槐豆膠、阿拉伯樹(shù)膠、果膠、蛋白角叉膠、刺槐豆膠、阿拉伯樹(shù)膠、果膠、蛋白膠、黃

41、芪膠等種類(lèi)。膠、黃芪膠等種類(lèi)。2）包埋技術(shù)）包埋技術(shù) p 采用干燥法、液膠法、水凝膠法等進(jìn)行采用干燥法、液膠法、水凝膠法等進(jìn)行人工種子的包埋。人工種子的包埋。p 干燥法干燥法: 最早采用的方法，主要依據(jù)聚氧最早采用的方法，主要依據(jù)聚氧乙烯，在乙烯，在23、相對(duì)濕度、相對(duì)濕度70%左右的黑左右的黑暗條件下將胚狀體逐漸干燥，包埋。暗條件下將胚狀體逐漸干燥，包埋。p如胡蘿卜人工種子。如胡蘿卜人工種子。 p 液膠法液膠法: 不經(jīng)干燥胚狀體，而是直接不經(jīng)干燥胚狀體，而是直接與流體混合后播入土壤中。與流體混合后播入土壤中。p 不適于人工胚的包埋，且做成的人工不適于人工胚的包埋，且做成的人工種子成活率低，易

42、死亡。種子成活率低，易死亡。p 水凝膠法水凝膠法 : 最常用的一種方法。用褐最常用的一種方法。用褐藻酸鈉等水溶性凝膠經(jīng)與藻酸鈉等水溶性凝膠經(jīng)與Ca2+進(jìn)行離進(jìn)行離子交換后凝固，用于包埋單個(gè)胚狀體。子交換后凝固，用于包埋單個(gè)胚狀體。水凝膠名稱水凝膠名稱濃度（濃度（%，W/V）絡(luò)合劑名稱絡(luò)合劑名稱濃度（濃度（mmol/L）藻酸鈉藻酸鈉藻酸鈉及明膠藻酸鈉及明膠角叉藻聚糖角叉藻聚糖洋槐豆膠洋槐豆膠0.505.02.05.00.20.80.41.0鈣鹽鈣鹽鈣鹽鈣鹽KCl或或NH4ClKCl或或NH4Cl3010030100500500用于包被體細(xì)胞胚的幾種水凝膠用于包被體細(xì)胞胚的幾種水凝膠 貯藏與發(fā)芽貯

43、藏與發(fā)芽 一般將人工種子貯藏在一般將人工種子貯藏在4-7低溫、相低溫、相對(duì)濕度小于對(duì)濕度小于67%的條件下。實(shí)際上，隨貯藏的條件下。實(shí)際上，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，人工種子的萌發(fā)率會(huì)顯著下降。時(shí)間的延長(zhǎng)，人工種子的萌發(fā)率會(huì)顯著下降。 現(xiàn)在已有胡蘿卜、芹菜、柑橘、咖現(xiàn)在已有胡蘿卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡膠等幾十種植啡、棉花、玉米、水稻、橡膠等幾十種植物的人工種子試種成功，但由于成本較高，物的人工種子試種成功，但由于成本較高，中國(guó)尚未應(yīng)用于生產(chǎn)。中國(guó)尚未應(yīng)用于生產(chǎn)。 黃連 人工種子取得了很大的進(jìn)展，但至今仍人工種子取得了很大的進(jìn)展，但至今仍有一些問(wèn)題沒(méi)有解決：有一些問(wèn)題沒(méi)有解決： 人工種

44、皮尚不盡如人意，貯藏困難人工種皮尚不盡如人意，貯藏困難 生產(chǎn)成本高生產(chǎn)成本高 流程復(fù)雜流程復(fù)雜4 局限性：局限性：第六章 營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)第一節(jié) 根的培養(yǎng)第二節(jié) 莖的培養(yǎng)第三節(jié) 葉的培養(yǎng)n器官培養(yǎng)（器官培養(yǎng)（Organ culture ） ：n主要指植物根、葉、莖、花、果實(shí)等器官在離主要指植物根、葉、莖、花、果實(shí)等器官在離體條件下，在無(wú)菌的人工環(huán)境種做進(jìn)一步培養(yǎng)體條件下，在無(wú)菌的人工環(huán)境種做進(jìn)一步培養(yǎng)發(fā)育，最終長(zhǎng)成幼苗的過(guò)程。發(fā)育，最終長(zhǎng)成幼苗的過(guò)程。n特點(diǎn)：特點(diǎn)：能保持它們所具有的特征性結(jié)構(gòu)，通過(guò)能保持它們所具有的特征性結(jié)構(gòu)，通過(guò)器官培養(yǎng)可快速大量地繁殖。器官培養(yǎng)可快速大量地繁殖。n 根培養(yǎng)的意

45、義根培養(yǎng)的意義:n1) 是進(jìn)行根系生理、代謝研究的最優(yōu)良實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行根系生理、代謝研究的最優(yōu)良實(shí)驗(yàn)體系體系;n2) 是研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系；是研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系；n3）可建立快速生長(zhǎng)的根無(wú)性系。）可建立快速生長(zhǎng)的根無(wú)性系。第一節(jié)第一節(jié) 根的培養(yǎng)根的培養(yǎng)n 離體根生長(zhǎng)迅速、代謝活躍。離體根生長(zhǎng)迅速、代謝活躍。n在離體根培養(yǎng)中，自然條件下生長(zhǎng)在土壤中的在離體根培養(yǎng)中，自然條件下生長(zhǎng)在土壤中的根要解決消毒問(wèn)題，是非常困難的，常用根要解決消毒問(wèn)題，是非常困難的，常用無(wú)菌無(wú)菌苗的根苗的根作為培養(yǎng)材料。作為培養(yǎng)材料。根無(wú)性繁殖性的建立根無(wú)性繁殖性的建立離體根的無(wú)性系離體根的無(wú)性系:

46、 由單個(gè)直根衍生，并經(jīng)繼代培養(yǎng)而由單個(gè)直根衍生，并經(jīng)繼代培養(yǎng)而保持遺傳性一致的根的培養(yǎng)物。保持遺傳性一致的根的培養(yǎng)物。根無(wú)性繁殖系根無(wú)性繁殖系10mm接后接后1周周側(cè)根側(cè)根反復(fù)轉(zhuǎn)接反復(fù)轉(zhuǎn)接無(wú)菌種子無(wú)菌種子 根培養(yǎng)的培養(yǎng)基：n無(wú)機(jī)離子較低的無(wú)機(jī)離子較低的White培養(yǎng)基培養(yǎng)基n或者或者2/3或或1/2的的MS、B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)程舉例：番茄舉例：番茄根的培養(yǎng)過(guò)根的培養(yǎng)過(guò)程程1.種子用種子用70%酒精消毒酒精消毒1分鐘；分鐘； 2.用飽和漂白粉液消毒用飽和漂白粉液消毒10分鐘；分鐘；3.用無(wú)菌水洗三次；用無(wú)菌水洗三次；4.將種子放入培養(yǎng)皿中的濕濾紙上；將種子放入培養(yǎng)皿中的濕濾紙上；5暗中培養(yǎng)暗

47、中培養(yǎng)直至胚根長(zhǎng)至直至胚根長(zhǎng)至3040mm；6.切取切取10mm根尖接種；根尖接種；7.在在25下培養(yǎng)直到長(zhǎng)出側(cè)根下培養(yǎng)直到長(zhǎng)出側(cè)根影響離體根生長(zhǎng)的因素影響離體根生長(zhǎng)的因素5 5、環(huán)境條件環(huán)境條件4 4、pHpH3 3、生長(zhǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)物質(zhì)2 2、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基1 1、基因型、基因型影響因素影響因素根培養(yǎng)的分化途徑根培養(yǎng)的分化途徑離離體體根根愈愈傷傷組組織織分分化化芽芽再再生生植植株株再分化培養(yǎng)基再分化培養(yǎng)基脫分化培養(yǎng)基脫分化培養(yǎng)基第二節(jié) 莖的培養(yǎng)n根據(jù)取材部位莖的培養(yǎng)可分為根據(jù)取材部位莖的培養(yǎng)可分為莖尖培養(yǎng)和莖段培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)和莖段培養(yǎng)。關(guān)于莖。關(guān)于莖尖培養(yǎng)詳見(jiàn)第七章。尖培養(yǎng)詳見(jiàn)第七章。莖段培養(yǎng)

48、莖段培養(yǎng): 指帶有腋（側(cè)）芽或葉柄、長(zhǎng)數(shù)厘米的莖節(jié)段進(jìn)行指帶有腋（側(cè)）芽或葉柄、長(zhǎng)數(shù)厘米的莖節(jié)段進(jìn)行離體培養(yǎng)。離體培養(yǎng)。n由于由于嫩莖段嫩莖段（即當(dāng)年萌發(fā)或新抽出的尚未完全木質(zhì)化的枝（即當(dāng)年萌發(fā)或新抽出的尚未完全木質(zhì)化的枝條），其細(xì)胞的可塑性大，容易離體培養(yǎng)，常作為外植體。條），其細(xì)胞的可塑性大，容易離體培養(yǎng)，常作為外植體。 莖 培養(yǎng)的意義n無(wú)性系快速繁殖；無(wú)性系快速繁殖；n培養(yǎng)無(wú)病毒苗，品種改良；培養(yǎng)無(wú)病毒苗，品種改良；n理論基礎(chǔ)研究。理論基礎(chǔ)研究。莖段培養(yǎng)過(guò)程莖段莖段 不定芽不定芽 再生苗再生苗 生根生根 盆栽盆栽 愈傷組織愈傷組織 芽分化芽分化舉例：苞舌蘭莖段的培養(yǎng)n培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：VW

49、大量大量+ MS微量微量+15%（g/v）椰子汁）椰子汁+5mg/L BA+1mg/LNAA，50天培養(yǎng)后天培養(yǎng)后n6.9%的莖段變褐后死亡，的莖段變褐后死亡，n44.8%形成一個(gè)側(cè)枝并再生成植株，形成一個(gè)側(cè)枝并再生成植株，n20.4%產(chǎn)生叢苗產(chǎn)生叢苗n27.9%分化出原球莖。分化出原球莖。舉例：舉例：懷山藥莖段的培養(yǎng)途徑懷山藥莖段的培養(yǎng)途徑:n不定芽途徑：不定芽途徑：MS+ 2mg/L KT+12mg/LPP333 + 0.02mg/L NAA，20天后從邊緣突起部位形成天后從邊緣突起部位形成35個(gè)不定個(gè)不定芽，芽，40天成苗。天成苗。n愈傷組織：愈傷組織：MS+6mg/LBA+ 0.022

50、mg/LNAA上，培養(yǎng)上，培養(yǎng)7天后在切口處形成白色愈傷組織。天后在切口處形成白色愈傷組織。n莖段分化的途徑與莖段分化的途徑與NAA濃度有關(guān)。濃度有關(guān)。nNAA由由0.02mg/L到到2mg/L，愈傷組織形成率由，愈傷組織形成率由50.3%提提高到高到82.5%，綠苗形成率由，綠苗形成率由25%下降到下降到7.1%。n后來(lái)證實(shí)，后來(lái)證實(shí)，在在NAA低濃度培養(yǎng)基中，通過(guò)莖切段直接成芽低濃度培養(yǎng)基中，通過(guò)莖切段直接成芽的頻率較高；而在的頻率較高；而在NAA濃度高的培養(yǎng)基中，通過(guò)愈傷組織濃度高的培養(yǎng)基中，通過(guò)愈傷組織形成芽的頻率較高。形成芽的頻率較高。舉例：影響月季莖段增殖培養(yǎng)的因素舉例：影響月季莖

51、段增殖培養(yǎng)的因素1）腋芽在莖段上的位置。）腋芽在莖段上的位置。p在無(wú)激素培養(yǎng)基上，在無(wú)激素培養(yǎng)基上，23天后，接近枝條最頂端和基部的天后，接近枝條最頂端和基部的芽發(fā)育最慢，而枝條芽發(fā)育最慢，而枝條中部的芽發(fā)育最快中部的芽發(fā)育最快。2）去莖頂端的作用。）去莖頂端的作用。 繼代培養(yǎng)時(shí)切去嫩莖的頂芽后，促進(jìn)嫩莖的增殖。繼代培養(yǎng)時(shí)切去嫩莖的頂芽后，促進(jìn)嫩莖的增殖。3）嫩莖長(zhǎng)度對(duì)形成多芽苗的影響。）嫩莖長(zhǎng)度對(duì)形成多芽苗的影響。1-10 mm，形成多芽苗最有效，側(cè)枝數(shù)也較多，形成多芽苗最有效，側(cè)枝數(shù)也較多，切割過(guò)短切割過(guò)短(小于小于1mm)或過(guò)長(zhǎng)或過(guò)長(zhǎng)(11-15mm)都對(duì)莖的增殖不利。都對(duì)莖的增殖不利。

52、4）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響。u植物生長(zhǎng)抑制劑植物生長(zhǎng)抑制劑三碘苯甲酸三碘苯甲酸促進(jìn)嫩莖增殖。促進(jìn)嫩莖增殖。u6-BA 1-3mg/L促進(jìn)莖增殖有效，濃度高會(huì)減少莖的促進(jìn)莖增殖有效，濃度高會(huì)減少莖的伸長(zhǎng)，也對(duì)下一步生根起抑制作用。伸長(zhǎng)，也對(duì)下一步生根起抑制作用。u1 mg/L 6-BA+1mg/L NAA，雖然使莖的增殖略有降，雖然使莖的增殖略有降低，但可使低，但可使莖伸長(zhǎng)莖伸長(zhǎng)。u赤霉素抑制赤霉素抑制月季莖的增殖。月季莖的增殖。第三節(jié)第三節(jié) 葉的培養(yǎng)葉的培養(yǎng)很多植物的葉片具有很強(qiáng)的再生能力，由于取很多植物的葉片具有很強(qiáng)的再生能力，由于取材方便，數(shù)量多且均一性較強(qiáng)，可以作為適

53、宜材方便，數(shù)量多且均一性較強(qiáng)，可以作為適宜的外植體。的外植體。葉培養(yǎng)的意義：1）研究葉形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成的好方法）研究葉形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成的好方法2）通過(guò)葉組織的脫分化與再分化證實(shí)葉細(xì)胞的全能性）通過(guò)葉組織的脫分化與再分化證實(shí)葉細(xì)胞的全能性3）通過(guò)葉組織培養(yǎng)，探索離體葉組織培養(yǎng)的條件和影）通過(guò)葉組織培養(yǎng)，探索離體葉組織培養(yǎng)的條件和影響因素響因素4）建立體細(xì)胞快速無(wú)性繁殖體系）建立體細(xì)胞快速無(wú)性繁殖體系5）葉細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)誘變篩選突變體。）葉細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)誘變篩選突變體。葉原基葉原基葉鞘葉鞘葉片葉片子葉子葉葉柄葉柄莖和根莖和根試管苗試管苗 不定芽不定芽 葉培養(yǎng)的分化途徑葉培養(yǎng)

54、的分化途徑愈愈傷傷組組織織番茄子葉培養(yǎng)百合鱗葉培養(yǎng)煙草葉片培養(yǎng)煙草葉片培養(yǎng)葉的培養(yǎng)：葉的培養(yǎng)：舉例：長(zhǎng)壽花實(shí)生苗的葉片的離體培養(yǎng)舉例：長(zhǎng)壽花實(shí)生苗的葉片的離體培養(yǎng)n葉片葉片誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織不定芽不定芽生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)移栽移栽n培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：MS+1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BAn 30天邊緣出現(xiàn)淡綠色顆粒狀突起，形成質(zhì)地致密的淡綠色愈天邊緣出現(xiàn)淡綠色顆粒狀突起，形成質(zhì)地致密的淡綠色愈傷組織。傷組織。n繼代培養(yǎng)后，獲得大量繼代培養(yǎng)后，獲得大量愈傷組織愈傷組織。n將愈傷組織切成將愈傷組織切成0.5cm0.5cm，接種到，接種到MS+ 1mg/LBA +0.1mg/LNAA上，

55、上，15天后愈傷組織明顯轉(zhuǎn)綠和增大；天后愈傷組織明顯轉(zhuǎn)綠和增大；n50天左右產(chǎn)生綠色芽點(diǎn)并陸續(xù)分化出芽，每塊愈傷組織可分天左右產(chǎn)生綠色芽點(diǎn)并陸續(xù)分化出芽，每塊愈傷組織可分化出化出56株無(wú)根苗，株無(wú)根苗，n1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，全部長(zhǎng)出不定根。上，全部長(zhǎng)出不定根。葉離體培養(yǎng)形成愈傷組織葉離體培養(yǎng)形成愈傷組織葉離體培養(yǎng)直接形成不定芽結(jié)構(gòu)舉例：綠巨人幼葉的離體培養(yǎng)舉例：綠巨人幼葉的離體培養(yǎng)n葉片葉片不定芽不定芽生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)移栽移栽nMS+0.20.5mg/LBA+0.72mg/L2,4-Dn5周后切口處出現(xiàn)綠色突起，周后切口處出現(xiàn)綠色突起，n再接種到不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基再接種到不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基(MS+23mg/LBA +0.30.4mg/LNAA)后，后，n34周形成不定芽，周形成不定芽，n切割小芽繼續(xù)培養(yǎng)，每切割小芽繼續(xù)培養(yǎng)，每4周可增殖周可增殖46倍。倍。復(fù)習(xí)思考題：復(fù)習(xí)思考題：1.1.莖段培養(yǎng)與莖尖培養(yǎng)有何區(qū)別？莖段培養(yǎng)與莖尖培養(yǎng)有何區(qū)別？2.2.葉片培養(yǎng)大致過(guò)程如何？葉片培養(yǎng)大致過(guò)程如何？