生物選修一第四章導(dǎo)學(xué)案1

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1、 旬陽中學(xué)生物選修一導(dǎo)學(xué)案 編號： 課題 ：蛋白質(zhì)的提取和分離 課時： 主編人：王富嬌 審核人：趙長敏 審批人：劉偉 日期 班組： 姓名： 組評： 師評： 學(xué)習(xí)目標(biāo)： 1.嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 學(xué)習(xí)重、難點(diǎn)： 1.凝膠色譜法的原理和方法 2.樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 第一學(xué)習(xí)時間 自 主 預(yù) 習(xí) 不看不講 & 基礎(chǔ)知識梳理（系統(tǒng)形象化） 知識回顧： 血液由 和

2、 組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有 的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì) ，其作用是 ，血紅蛋白有 個肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈環(huán)繞一個 ，磁基團(tuán)可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅色。 思考1：你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？ 思考2：與其它真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？ 基礎(chǔ)知識 一

3、、實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。 二、 實(shí)驗(yàn)步驟 可分為四大步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 1．樣品處理 （1）紅細(xì)胞的洗滌 ①目的：去除 雜質(zhì)蛋白 ②方法：低速短時間離心（速度越高和時間越長會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的 黃色血漿，將下層暗紅色的的紅細(xì)胞液體倒入燒杯再加入用 五倍的 體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．9％的氯化鈉溶液洗滌。 ⑤低速離心（低速短時間） ⑥重復(fù)4、5步驟 三 次，直至上清液

4、中已沒有 黃色 ，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。 （2）血紅蛋白的釋放 在蒸餾水和40%甲苯作用下，攪拌10min,紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。 加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。 細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，破碎的方法不同，常用有： 2. 粗分離 ①分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。 第1層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白

5、的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)沉淀物(暗紅色)。 將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 ②透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。 目的：可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。 3． 純化（一般采用凝膠色譜法對血紅蛋白進(jìn)行分離和純化） 純化主要是根據(jù)蛋白質(zhì)之間以及 與其他物質(zhì)之間在分子大小、 、 、 等方面純在的差異進(jìn)行的。常用的方

6、法有： （其原理見名師P38） 4. SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定 判斷 的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。 SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度 SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。 思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？ 第二學(xué)習(xí)時間 新 知 學(xué) 習(xí) 不議不講 & 重難點(diǎn)合作探究（技能系統(tǒng)化） 一．凝膠色譜法（原理） 凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù)

7、 分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時速度不同，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動速度 ；而相對分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動，路程 ，移動速度 。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 具體過程： 凝膠顆粒 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) （1） （2） （3） （4） （5） B A

8、 多孔板 A． 的蛋白質(zhì)由于 作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留； 的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在了里之間迅速通過。 B．1） 混合物上柱； 2）洗脫開始， 的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)； 的蛋白質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外； 3） 的蛋白質(zhì)被滯留； 的蛋白質(zhì)被向下移動。 4） 不同的蛋白質(zhì)分子完全分開

9、； 5） 的蛋白質(zhì)行程較短，已從 中洗脫出來， 的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。 2．緩沖溶液 緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，例如：血漿的pH是 ，要在實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。 思考：說出人體血液中緩沖對？ 思考：在血紅蛋白整個實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是什么？它的目的

10、是什么？ 3．凝膠色譜操作 第一步要制作 ，第二步要 ，因?yàn)? ，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時，不得有 存在。因?yàn)闅馀輹? ，降低分離效果。第三步是 。 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，分子量大的蛋白質(zhì) （ ） A．路程較長，移動速度較慢 B．路程較長，移動速度較快 C．路程較短，移動速度較慢 D．路程較短，移動速度較快 二、電泳

11、 （1）概念：電泳是指 。 （2）原理：許多重要的生物大分子，如 等都具有 。 在 下，這些基團(tuán)會帶上 。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其 移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子 以及分子本身 、 的

12、不同使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 兩種常用的電泳方法是 和 ，在測定蛋白質(zhì)分子量時通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。（3）泳動特點(diǎn)：帶電顆粒直徑越小，越接近于球形，所帶近電荷 ， 在電場中泳動速度就 ，反之，則慢。 三、注意事項(xiàng) 1. 電泳技術(shù) 電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用

13、待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。 2．加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 3．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義？ 哺乳動物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。 4. 紅細(xì)胞的洗滌 如果分層不明顯

14、，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 5．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 6．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？ 如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部

15、的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。 7．沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的？ 不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。 8．G-75的含義？ “G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。 9．裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密 10．如何檢測血紅蛋白的分離是否成功？ 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

16、11. 如何測定蛋白質(zhì)的分子量？ 使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。 【課堂總結(jié)】 血 紅 蛋 白 的 取 和 分 離 凝膠色譜法 原 理 分離過程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質(zhì)的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 離 蛋白質(zhì)分子的差異性 蛋白質(zhì)分子的差異性 凝膠色譜法

17、 原 理 分離過程 凝膠電泳法 凝膠色譜法 原 理 分離過程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質(zhì)的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 蛋白質(zhì)的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 第三學(xué)習(xí)時間 課 程 訓(xùn) 練 不練不講 ! 自我檢測（能力具體化，練習(xí)層次化） 一、非選擇題 1、細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分

18、離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題： （1）血紅蛋白提取和分離的程度可分為四步：______、______、______和______。 （2）實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。 ①加入檸檬酸鈉的目的是__________________。 ②以上所述的過程即是樣品處理，它包括______、______、收集血紅蛋白溶液。 （3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。 ①透析的目的是__________________。 ②透析的原理是______________________

19、________。 （4）然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 ①樣品純化的目的是______________________________。 ②血紅蛋白有什么特點(diǎn)？______________________________。這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？_______________________________。 2、下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的加入(圖I)和洗脫(圖Ⅱ)示意圖，請據(jù)圖回答下列問題。 (1)在加樣示意圖中，正確的加樣順序是 。 (2)用吸管加樣時，應(yīng)注意正確操作，分別

20、是① 。②貼著管壁加樣、③ 。(3)等樣品 。時，才加入緩沖液 。 待 接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每 mL收集一管，連續(xù)收集。 3、凝膠色譜技術(shù)是一種快速而又簡單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且，已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題： （1）a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是 ，原因是

21、 。 （2）自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由 替代。 （3）裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是 。 （4）洗脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡凝膠所用的液體 (填“相同”或“不同”)，洗脫時，對洗脫液的流速要求是 。 49．早在上世紀(jì)六十年代，在美國的黃石國家森林公園發(fā)現(xiàn)了一種嗜熱細(xì)菌，從這種細(xì)菌中分離提取了一種酶，稱為TaqDNA聚合酶。實(shí)

22、驗(yàn)得知PCR反應(yīng)變性時溫度為950C，經(jīng)50個循環(huán)后TaqDNA聚合酶仍有65%的活性； TaqDNA聚合酶表現(xiàn)為Mg2+依賴，濃度在2．0mmol/L的MgCl2能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性 ； （1）若要培養(yǎng)嗜熱細(xì)菌，培養(yǎng)基中應(yīng)有水、碳源、 、 等營養(yǎng)物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，培養(yǎng)該菌時需先將培養(yǎng)基 。 （2）若將培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基用于植物組織培養(yǎng)，還應(yīng)加入 。 （3）TaqDNA聚合酶可用于PCR，原因是該酶有 ，因此在PCR擴(kuò)增時可以 加入。 （4）請將下列實(shí)驗(yàn)流程圖補(bǔ)充完整： （5）凝膠色譜法和凝膠電泳法是分離蛋白質(zhì)的兩種常用方法，據(jù)此回答問題。 ①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)不同大小的蛋白質(zhì)分子在凝膠柱中的 不同而實(shí)現(xiàn)分離的： ②使用電泳法分離蛋白質(zhì)．是利用了待分離樣品中各種分子的 差異，以及分子本身的 、形狀的不同。 - 9 - 崇德 勵志 篤學(xué) 尚健